1 引 言
1991年,在由Fodor等人提出DNA芯片的概念后,近年来以DNA为代表的生物芯片技术得到了迅猛的发展[1]。迄今已有近百家公司从事与生物芯片相关的工艺、设备、检测和软件的研究。在生物芯片发展的短短十几年中,前人提出了多种检测技术,包括放射性同位素标记法、荧光标记法[2,3]、生物素标记法、表面等离子激元共振法[4]、质谱法、化学发光法、电化学法、光散射法等。由于荧光标记法无毒害、灵敏度高、直观、可进行多色标记的优点,所以在目前的检测系统中,绝大部分都是基于荧光标记,并且有相当一部分已经商品化。由荧光标记的生物检测系统大部分都采用了激光共焦技术。该系统具有分辨能力强、灵敏度高、定位功能强等优点。本文阐述的新型检测扫描仪是在传统的激光共焦系统的基础上通过改进得到的。
2 激光共焦扫描仪的工作原理
激光共焦扫描荧光探测系统的工作原理图如图1所示[1]。
激光器1发射出来的激光由透镜组2扩展成直径较大的平行光束,经激发窄带干涉滤光片3后,过滤除去其它波长的光,这样可大大降低检测的背景噪声。经分束镜5反射至物镜组6。物镜组6将激光聚焦在生物芯片7上,聚焦后的光斑直径一般为几个微米到几十个微米。标记由荧光染料的靶分子在激光激发下产生发射荧光,该荧光由物镜组6收集捕获后变成平行光,通过分束镜5,由反射镜9反射至窄带干涉滤光片10,以滤除除发射荧光以外的光,再由透镜组11聚焦在共轭探测针孔12上。通过探测针孔中的CCD检测,并经放大器放大,其放大信号在由A/D转换器将模拟信号转换成数字信号后,由计算机采集存贮。由马达驱动芯片平台作X-Y两个方向的二维移动。
3 光学系统设计
对于组织芯片、细胞芯片等生物芯片来说,由于需要进行实时添加药物与试剂,工作距离越大操作越方便,因此考虑到实际需要,要求该光学系统的工作距离不小于15mm。由于在像方采用了分辨率为6~8μm的CCD接收,因此要求光学系统的像方传递函数在特征频率为70线对时为0·3;由于要求物方的分辨率<400nm,因此放大倍率应为20倍。若
物方传递函数在特征频率为1400线对时约为0·3,则物方分辨率约为350nm。由于激发出的荧光通常都很微弱,要想清晰地观察荧光效果,所以不但物镜的成像质量较一般物镜要高,而且集光能力要强。由于物镜的数值孔径越大,集光能力就越强,观察荧光的效果就越佳,因此系统的数值孔径要求不小于0.65;由于扫描仪的激发波长为532nm,激发出来的荧光是570nm,因此该光学系统的工作波段为530~580nm。根据上述设计目标,对系统进行了如下设计:
(1)选型。欲获得长工作距离,最为常用且有效的方法是物镜用正、负两个组件组成[5]。正组靠近物体一侧,负组靠近像方一侧。在焦距一定的情况下,如果正、负组件分离得越远,则物方主面越移向物体,即工作距离越长。考虑到数值孔径,决定采用阿米西型物镜。然而要想获得长工作距离,必须在阿米西型物镜后增加一负组件,相应地,在阿米西型物镜中需要增加一个正单透镜,以便产生正偏角与之平衡。物镜结构如图2所示。
(2)系统结构。考虑到在光路中要入分束镜、滤色片、偏振片等附件,所以光学系统被分为前后两组。由于在分成前后两组后增加了透镜的片数,这就更加有利于像差的校正。如果采用传统的共焦系统,即前后两组用平行光偶合的方法,要想获得20倍的放大率,则根据高斯光学,前后两组的焦距之比必须为20倍,这样就大大增加了系统的总长度。因此采用了两组之间成一个中间像,两组的放大倍率分别为10倍和2倍,如图3所示。整个扫描仪的结构如图4所示。
(3)像差校正。由于该系统的工作距离长,数值孔径大,必然使得物镜的孔径很大。由像差理论可知[6],主要需要消除的像差是轴上点球差、彗差(正弦差)以及轴向色差,尤其是要消除这些像差的高级像差。由上面的分析可知,系统分成了前后两组,由于前组的孔径及放大倍率较后组大得多,因此应当尽可能独立地校正前组的像差,前组实在消除不了的像差可以由后组适当进行补偿。对于前组来说,考虑到场曲及工作距离,第一个单透镜采用了月牙透镜,其凹面处于反常区域;第二个单透镜同样是月牙透镜,它承担了较大的偏角,通过产生相当数量的高级负球差来平衡物镜的高级正球差;两个双胶合透镜通过产生相当数量的正色差来平衡两个单透镜的负色差。最后的负组件将产生一定的像散和高级负球差。通过实际的ZEMAX仿真优化设计不难发现,由于玻璃片数较多,只要选择了合适的初始结构,通过自动校正程序调整玻璃的曲率半径、玻璃的厚度以及玻璃之间的间隔,就可以达到消除高级球差和高级彗差的目的。由于物镜的孔径太大,两个双胶合透镜产生的正色差无法平衡单透镜的负色差,因此必须使单透镜产生的色差尽可能的小。这里采用了色散系数比较大磷冕(PK)玻璃作为单透镜的玻璃材料,可以大大减小高级色差[7]。
4 光学系统的设计结果
通过用ZEMAX软件进行优化设计,最终设计出了成像质量优良的物镜。图5和图7是像方的传递函数(MTF)图和点列图,反映了像方的成像质量;图6和图8是物方的传递函数(MTF)图和点列图,反映了物方的成像质量。由图5可以看出,像方传递函数在70线对时大约为0·26,理想的传递函数和实际的传递函数很接近。由图6可以看出,物方传递函数在1400线对时大约为0·25,物方分辨率=1×106/(2×1400)≈350nm,具有很高的分辨率。
5 结 论
本文所设计的系统是在传统的激光共焦扫描荧光探测系统的基础上改进的,增大了放大倍率,加大了工作距离,扩大了数值孔径。放大倍率达到了20倍,工作距离为15mm,数值孔径达到了0.67,物方分辨率大于350nm。下一步要开展的工作是进一步扩大工作波长的范围,争取在工作波长为400~700nm时成像质量与现在的成像质量差不多。
参考文献:
[1]马立人,蒋中华.生物芯片[M].北京:化学工业出版社,2002.93—98.
[2] Montagu J,Honkanen P.Fluorescence array scanner[J].Proceed-ings of SPIE,1999,3779:284—292.
[3] Evan T,Ofer L,Wang K,et al.High throughput integration of op-toelectroNIcs devices for biochip fluorescent detection[J].Proceed-ings of SPIE,2003, 4982:162—169.
[4] Michael J O Brien I I,Victor H Perez-Luna,Brueck S R J,et al.Asurface plasmon resonance array biosensor based on spectroscopicimaging[J].Biosensors Bioelectronics,2001,16:97—108.
[5]王之江,等.光学技术手册[M].北京:机械工业出版社,1987.971—973.
[6]袁旭沧,等.光学设计[M].北京:北京理工大学出版社,1988.47—108.
[7]李士贤,李林.光学设计手册[M].北京:北京理工大学出版社,1996.1—3.
作者简介:王钱(1980-),女,湖北省应城市人,北京理工大学信息科学技术学院光电工程系硕士研究生,主要从事生物芯片检测扫描系统光学设计的研究。
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