０引言
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，近５０年来，世界各国肺癌的发病率和死亡率总体呈上升趋势。研究表明ｐ５３基因突变与肺癌密切相关，因此，ｐ５３基因的早期、准确、定量检测很重要［１－２］，但由于早期肺癌细胞的特征ＤＮＡ含量和浓度较低，准确检测难，要解决这个难题，最有效的方法之一是对肺癌特征的ｐ５３基因片段进行质量检测。近年来，石英晶体微天平（ＱＣＭ）因其准确度和精度高（可达纳克级），在生化分析、疾病诊断领域备受青睐［３－４］。
ＱＣＭ生物检测的研究重点是选择合适的核心修饰材料以实现探针最大量的有效固定，因此，具有导电性好，催化活性高，比表面积大，吸附能力强，生物相容性好等特征的碳纳米管［５］是一个很好的选择。目前，已有少量利用碳纳米管制备压电生物传感器的报道［６－７］，多集中在免疫类，但未见用于制备肺癌压电ＤＮＡ传感器。
本文利用羧基化碳纳米管交联电极表面半胱胺自组装膜和ＤＮＡ探针，提高对肺癌特征ＤＮＡ探针的有效固定量，研制一种新型的肺癌压电ＤＮＡ传感器，实现对肺癌特征ｐ５３基因片段灵敏、准确的质量检测，为肺癌的早期诊断提供一个新的、快捷的途径。
１ 实验部分
１．１ 仪器与试剂
ＱＣＭ压 电 检 测 器、压 电 石 英 晶 体 （ＡＴ－切，１０ＭＨｚ，镀金，晶片直径为Ø８ ｍｍ，电极直径为Ø６ｍｍ）、数据采集卡、氮气干燥室（自制）、肺癌特征ＤＮＡ探针（ｐ５３寡核苷酸探针）：５′－ＸＡＧＴ ＡＣＧＧＣＡ ＴＴＧ ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＧ－３′（Ｘ＝ＮＨ２）及肺癌特征ＤＮＡ（探针对应ｐ５３基因片段）、８０１－Ｄ人巨细胞性肺癌细胞、多壁碳纳米管（ＭＷＣＮＴｓ）、半胱胺、１－乙基－３－（３－甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ）、Ｎ－羟基琥珀酰亚胺（ＮＨＳ）、Ｐｉｒａｎｈａ溶液（９８％Ｈ２ＳＯ４∶３０％Ｈ２Ｏ２＝３∶１（体积分数）），其他药品均为分析纯，实验用水均为重蒸水。
１．２ 实验方法
实验操作主要包括ＤＮＡ探针固定、标品检测，如图１所示。
１．２．１石英金电极的预处理
石英金电极于Ｐｉｒａｎｈａ溶液中浸泡清洗３ｍｉｎ，丙酮浸泡清洗３ｍｉｎ，去离子水浸泡清洗３ｍｉｎ，重复２次，然后将电极于氮气干燥室干燥备用。
１．２．２羧 基 化 的 多 壁 碳 纳 米 管 （ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ）的制备及活化
参照文献［８］制备ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ，在氮气室干燥 后 备 用，用 前 置 于５．０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＣ和８．０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨＳ混合溶液中活化１ｈ。
１．２．３传感器体系的建立
操作主要分３步：
１）将预处理的石英金电极于１ｍｍｏｌ／Ｌ半胱胺溶液中浸泡１６ｈ，取出后用磷酸缓冲液（ｐＨ＝７．４）清洗，再于氮气室干燥。
２）滴加２０μＬ活化的ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ于金电极表面上，放置３０ｍｉｎ，然后用磷酸缓冲液（ｐＨ＝７．４）清洗，再于氮气室干燥。
３）滴加２０μＬ ＤＮＡ探针溶液，置于饱和水蒸气环境下反应１ｈ，然后用０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ和０．２５％ＳＤＳ溶液依次清洗电极，再用少量磷酸缓冲液（ｐＨ＝７．４）清洗，后放置氮气室干燥。
１．２．４检测方法
均匀滴加１５μＬ、５μｇ／ｍＬ肺癌特征ＤＮＡ或样品于金电极表面，然后用压电测定，记录频率变化值，直至频率变化值（ΔＦ＜１Ｈｚ／ｍｉｎ）稳定。
２ 结果与分析
２．１单因素实验
２．１．１ ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ浓度的影响
在磷酸缓冲溶液（ｐＨ＝７．４）、２５μｇ／ｍＬ ＤＮＡ探针条件下，确定ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ浓度对肺癌特征ＤＮＡ检 测 的 影 响，实 验 选 用 浓 度 （ｃ）分 别 为１ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ及９ｍｇ／ｍＬ，记录检测肺癌特征ＤＮＡ的频率下降值（ΔＦ）。实验发现，ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ浓度为５ｍｇ／ｍＬ时的频降峰值为１６０ Ｈｚ；ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ浓度低于５ｍｇ／ｍＬ时，频率下降值与浓度值正相关；ＭＷＣ－ＮＴｓ－ＣＯＯＨ浓度大于５ｍｇ／ｍＬ时则负相关。由此可知，当ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ在低浓度范围内，增加其浓度可增加ＤＮＡ探针的固定量，当浓度达到某一临界值时，ＤＮＡ探针固定饱和，如继续增加浓度，过多的碳纳米管会产生高位阻，从而降低探针的有效固定。
２．１．２ ＤＮＡ探针浓度的影响
在磷酸缓冲溶液（ｐＨ ＝７．４）、５ｍｇ／ｍＬ ＭＷＣ－ＮＴｓ－ＣＯＯＨ条件下，选用浓度为１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ和５０μｇ／ｍＬ的ＤＮＡ探针进行实验，记录检测肺癌特征ＤＮＡ的频率下降值。实验发现，ＤＮＡ探针浓度为３０μｇ／ｍＬ时，频率下降达最大值（峰值为１６６Ｈｚ），这表明此浓度下ＤＮＡ探针有效固定至饱和。
２．１．３溶液ｐＨ值的影响
在５ ｍｇ／ｍＬ ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ、３０μｇ／ｍＬＤＮＡ探针条件下，确定溶液ｐＨ值对样品检测的影响，选用ｐＨ值为６．６、７．０、７．４、７．８、８．２的磷酸缓冲溶液进行实验，记录检测肺癌特征ＤＮＡ的频率下降值。实验可知，磷酸缓冲溶液的ｐＨ＝７．４时，频率下降达最大值（峰值为１６６Ｈｚ）。
２．２ 实验条件的正交优化
２．２．１正交实验实验
基于上述单因素的分析结果，拟定正交设计方案进 行 实 验，力 求 找 出ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ浓 度、ＤＮＡ探针浓度、ｐＨ值的最佳配比，从而提高对肺癌特征ＤＮＡ检测的灵敏度。正交实验设计如表１所示。表中，ｋ１，ｋ２，ｋ３分别表示水平号为１，２，３时所对应的实验结果的平均数；Ｒ为极差。方差分析结 果 如 表２所 示。Ｆ表 示 方 差 分 析 检 验 值，Ｆ（０．０５）临界 值 为 从Ｆ分 布 表 中 查 得Ｆ（０.05 )（２，２）的值；显著性为ＳＰＳＳ软件计算所得的ｓｉｇ．值，是显著性指标，ｓｉｇ．＜０．０５为显著，否则为不显著。
结合表１、２可知，实验条件对ＤＮＡ检测影响程度为ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ浓度＞ＤＮＡ探针浓度＞溶液ｐＨ值，最佳的组合为Ａ１Ｃ３Ｄ２，即ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ浓度为４ｍｇ／ｍＬ，ＤＮＡ探针浓度为３５μｇ／ｍＬ，缓冲液ｐＨ＝７．４。
２．２．２实验优化条件验证
本文对上述优化条件进行验证，重复３次，记录检测肺癌特征ＤＮＡ的频率下降值。结果显示频率下降 均 值 为１７７ Ｈｚ，略 高 于 正 交 实 验 中 的 峰 值１７５Ｈｚ，且相对标准偏差（ＲＳＤ）为１．５％，表明本文正交设计是有效可行的。
２．３ 传感器的再生
用浓度为０．２５ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ洗脱２０ｍｉｎ，浓度为０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ洗脱３０ｍｉｎ，实现ＤＮＡ探针电极再生，可重复再生４次，超过４次则不适用检测。
２．４ 固定化时间
在石 英 金 电 极 表 面 滴 加 活 化ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ，测定频率下降值，发现３０ｍｉｎ后频率稳定.６２ｍｉｎ后频率波动较大，这表明３０ｍｉｎ后活化的ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ在电极上吸附饱和，频降值达到峰值，６２ｍｉｎ后出现不稳定吸附，因此，选用３０ｍｉｎ作为ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ固定时间；同理，ＤＮＡ探针在金电极表面达到稳定饱和吸附时间为１ｈ，杂交检测达到稳定饱和吸附时间为６８ｍｉｎ。
２．５ 传感器的主要响应特性
在正交实验优化条件下，测定不同浓度待测物频率下降值ΔＦ，绘制ΔＦ－ｃ曲线（见图２）。结果表明，在０．０２～７．５μｇ／ｍＬ呈现线性关系，回归方程为ｙ＝２７．６１７ｘ＋３２．５２３，相关系数为０．９９６ ４。在过低浓度下，杂交反应受非特性结合的影响较大，会偏离直线；在高浓度下，可结合的位点趋于饱和，也会偏离直线。
２．６ 比较实验
为确定ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ对ＤＮＡ探针在电极上有效固定的作用，在正交优化的实验条件下构建电极，检 测５μｇ／ｍＬ肺 癌 特 征ＤＮＡ，比 较 有 无ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ情况下对检测灵敏度的影响，结果如图３所示。未修饰ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ的传感器的响应峰值为７３ Ｈｚ，而修饰ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ的传感器的响应峰值为１７７Ｈｚ。实验结果表明，碳纳米管可增敏肺癌特征ＤＮＡ检测。
２．７ 样品分析 用研制 的 压 电 生 物 传 感 和 聚 合 酶 链 式 反 应（ＰＣＲ）法对１２例８０１－Ｄ人巨细胞性肺癌细胞样本进行检测，重复４次，结果如表３所示。由表可知，两种检测结果基本一致。阴性和阳性频降峰值呈显著差异，当ΔＦ１／ΔＦ０≥３．３（其中△Ｆ１为阳性样品所引起的频率变化，ΔＦ０为阴性样品所引起的频率变化)时，可判断该样品为阳性。
３ 结束语
本文基于碳纳米管的表面积放大效应和生物相容性，构建了半胱胺－羧基化碳纳米管生物压电传感器，用于肺癌特征ＤＮＡ的检测，与未加碳纳米管的传感器比较，检测灵敏度更高，可用于实际样品检测，并与ＰＣＲ法无显著差异，具有临床应用价值。
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本文作者：谯康全 吴永强 刘新露
