1 引 言
共焦扫描显微术是80年代迅速发展起来的新型成像技术,在生物学、医学等诸多领域有着广泛应用。它能对样品作无损的分层扫描成像,然后三维重建。因此,光学层切性质是共焦扫描显微术的最大优点,提高共焦扫描显微术的轴向分辨率显得尤为重要[1,2]。鉴于此,本文将着重分析共焦扫描显微术中影响轴向分辨率的各种因素,并讨论优化轴向分辨率的可能途径。
2 探测器状况对轴向分辨率的影响
图1为反射式共焦扫描系统的典型构成。假定一强度分布为S(x1,y1)的非相干光通过孔径函数为P(ξ1,η1)的显微物镜聚焦到样品上,其振幅反射系数为t(x0-xs,y0-ys)。从样品回来的反射光被孔径函数为P(ξ2,η2)的集光镜聚焦到非相干探测器上,其强度响应函数为D(x2,y2)。如果将系统看成为部分相干成像系统,则探测器接收到的光强信号为[2,3]
式中
这里C(m,n;p,q)为部分相干传递函数,它反映空间频率分量(m-p,n-q)通过成像系统的传输性质。λ为光波长,f为物镜焦距,并假定系统为单倍率成像系统。
如果以理想反射体
作为样品,并根据轴向响应函数来考察系统的轴向分辨率,则有
u是轴向归化光学坐标,其与光瞳函数的关系为
与实际沿轴坐标z的关系为
这里sinα为物镜的数值孔径。
若引进G(α,β)的傅氏变换形式G(vx,vy),则(3)式可改写为
其中符号“ ”代表卷积运算,v为径向归化光学坐标,它与实际径向坐标r的关系为
vx和vy为归化光学坐标分量,它与v的关系为
至此,我们可依据(3)式或(4)式来讨论探测器状况对系统轴向分辨率的影响。若采用单元探测器作为信号接收器件,则由于光源强度分布和探测器响应分布一般都是非负函数,g(vx,vy)因而也必然为非负函数。由(4)式可知,如果g(vx,vy)为非负,则点源点探测器情形对应于最大的轴向分辨率;而当单元探测器件尺度增大时,系统轴向分辨率将下降。若采用面探测器作为信号接收器件,则情况就大不相同。我们可将不同探测单元的信号作权重叠加,进而构筑出所需的响应函数D(vx,vy)和g(vx,vy),显然可以允许有负响应。因此,对于面阵探测器情形,我们能构筑轴向响应曲线,使其主瓣宽度小于理想共焦情形的对应宽度。轴向响应曲线的巨大旁瓣也能被设计在样品轴向尺度之外,从而实现所谓的有限景深轴向超分辨[4]。
以下考证单元探测器尺度对系统轴向分辨率的影响。参见图2的实验装置,以反射镜作为样品,光源采用Ar+激光,并经光栅单色化处理(图中未示出),工作波长为488 nm。单元探测器尺度则通过改变其前的小孔来控制。图3展示了不同集光镜数值孔径与小孔尺度条件下的轴向响应曲线。很显然,轴向响应曲线与小孔归化光学尺度vd有关,其定义为
式中rd为小孔半径,sinαd为集光镜的数值孔径。
实验中,实际小孔的归化光学尺度都不满足理想共焦条件vd≤2.5[5]的要求,因此图3中的实际响应曲线没有出现零响应点。利用图中的这些响应曲线作加权叠加,可以构筑轴向超分辨响应曲线。如图4所示,选用两组曲线作加权处理,构筑出的响应曲线,其轴向分辨率优化效应已经显见。
3 探测小孔位置对轴向分辨率的影响
关于探测小孔偏离理想位置对轴向分辨率的影响,文献[6,7]中已有分析。以下通过实验来考证小孔位置对系统轴向分辨率的影响。图2中的物镜选用数值孔径为0.25,共轭距为195mm,集光镜数值孔径为0.25,探测小孔半径rd=2.5μm。
图5示出了小孔在三个不同位置处的响应曲线,为便于比较已对曲线作了平移,鉴于实验中探测小孔归化光学尺寸vd=8,明显不满足理想共焦条件,因而其轴向响应曲线半强度宽度即使在焦点处也比理想共焦情形要宽,并且零点已经消失。此外,球差因素(物镜共轭距使用条件不符合要求)也使响应曲线半强度宽度变宽。当小孔位置由焦点处沿轴移动到焦前位置和焦后位置的同时,其横向位置也发生了一定的偏移,因而其轴向响应曲线的半强度宽度又比焦点处增宽,响应曲线的非对称性主要来源于物镜球差和透过率分布的非均匀性。
4 光瞳函数对轴向分辨率的影响
利用光瞳变迹术如圆环透镜,可以提高成像系统的横向分辨率,但同时会改变成像系统的轴向分辨特性[7,8]。现以圆环透镜为例,考证光瞳函数对系统轴向分辨率的影响。实验装置参见图2,选用数值孔径为0.30的物镜,无穷远共轭。
图6为物镜中心遮挡、集光镜中心遮挡和无中心遮挡三种不同条件下系统轴向响应的实验曲线。在探测器归化光学尺度vd= 8的条件下,使用0.5遮挡比的物镜和透明集光镜,或者使用0.5遮挡比的集光镜和透明物镜,系统轴向分辨率都比无中心遮挡时提高了,而且物镜中心遮挡与集光镜中心遮挡的效果相似。
图7为无中心遮挡与有中心遮挡两种情形下,轴向响应曲线半强度宽度随小孔归化光学尺度变化的比较曲线。结果表明,当探测器为有限尺度时,中心遮挡能提高系统的轴向分辨率。图8为轴向响应曲线半强度宽度随中心遮挡比变化的实验曲线。结果表明,对于特定探测小孔归化尺度来说,中心遮档比存在一优化值,使得轴向响应曲线的半强度宽度达到最小。本实验中遮挡比的优化值约为0.55,它对应于探测小孔归化尺度vd= 8。
5 讨论与结论
共焦扫描显微术中轴向分辨率受单元探测器尺寸、探测器位置精度、物镜像差、光瞳函数等多种因素制约。如果系统中采用低倍率的集光镜,则可缓解探测器尺寸与位置精度对轴向分辨特性的影响。物镜像差则是系统轴向分辨特性的最后制约因素。
利用圆环透镜和有限尺度探测小孔的组合可以优化共焦系统的轴向分辨性质,削弱物镜球差的消极影响,并确保有较高的能量通过率。
采用面阵探测器替代常规的小孔探测器,可以实现系统的负值响应,进而构筑出超分辨响应曲线。
参考文献
1 C. J. R. Sheppard. ScanNIng Optical Microscopy. in Advances in Optical and Electron Microscopy, Vol.10, R. Barer, V. E. Cosslett Eds., London: Academic Press, 1987. 1～98
2 T. Wilson. Confocal Microscopy. London: Academic Press, 1990. 93～184
3 T. Wilson. Depth response of scanning microscopes.Optik, 1989,81(3):113～118
4 Z. Ding, Z. Bao, W. Tianet al.. Superresolution in confocal scanning system.Proceedings ofJICAST’98/CPST’98, 1998. 233～236
5 T. Wilson, A. R.Carlini. Size of the detector in confocal imaging systems.Opt.Lett., 1987,12(4):227～229
6 T. Wilson, A. R. Carlini. Effect of detector displacement in confocal imaging systems.Appl.Opt.,1988,27(18):3791～3799
7 S. Kimura, T. Wilson. Effect of axial pinhole displacement in confocal microscopes.Appl.Opt., 1993,32(13):2257～2261
8 C. J. R. Sheppard, M. Gu. Improvement of axial resolution in confocal microscopy using an annularpupil.Opt.Comm., 1991,84(1,2):7～13
作者：丁志华 包正康 刘 昱 包晓晖(浙江大学现代光学仪器国家重点实验室 杭州310027)
