摘 要:双轴共焦显微技术具有独特的非共轴结构,与传统单轴共焦显微技术相比可利用较低数值孔径物镜实现较高的轴向分辨力,且具有工作距离大、信噪比高等优势。对基于CCD虚拟针孔(VPH)探测的双轴共焦显微成像系统的空间分辨特性进行了理论分析,并构建了相应的实验系统,对其轴向响应进行了实验验证。实验中照明物镜NAi=0.117,采集物镜NAc=0.106,θ=45°,得出系统轴向半高宽(FWHM)为2.63μm,比同等参数(NA=0.117)下单轴共焦显微系统的轴向FWHM高出约20倍。
0 引 言
双轴(DA)共焦显微技术具有独特的非共轴结构[1—4],该结构将被测样品与照明光轴成一定角度放置,则照明光轴与采集光轴形成一定的角度,从而使得照明系统和采集系统的点扩散函数(Pointspread function, PSF)相互制约,达到减小系统的合成焦体体积,提高系统轴向分辨力的目的。与传统单轴(SA)共焦显微技术相比,双轴共焦显微技术可利用较低数值孔径物镜实现较高的轴向分辨力,且具有工作距离大、信噪比高等优势。本文对基于CCD虚拟针孔(VPH)探测[5]的双轴共焦显微成像系统的空间分辨特性进行了理论分析,并构建了相应的实验系统,对其轴向响应进行了实验验证,为后续研究提供了理论基础与实验数据。
1 虚拟针孔(VPH)双轴共焦显微成像系统
1.1 双轴共焦结构
理想衍射受限系统三维PSF的中心亮斑可以认为是一个椭球体。如果我们令该椭球体的三个轴长分别等于共焦系统x、y和z轴方向的PSF的半高宽(FWHM)的两倍,那么该椭球体可以包含由光瞳出射的82%的亮度。定义该椭球体为焦体(focalvolume)[1],其体积决定了系统单次采样所能测量到的样品区域的大小,即决定了系统的空间分辨力。要改善系统的分辨力,实际就是减小焦体体积。
共焦显微系统的PSF是照明PSF与采集PSF的乘积。对于传统的单轴共焦结构,其焦体是一个z方向轴长大于x和y方向轴长的椭球体,因此单轴共焦系统的横向分辨力要比轴向分辨力高3~4倍[1]。对于双轴共焦结构,采用独立的照明物镜(IL)和采集物镜(CL)构建照明光路和采集光路,使照明光轴和采集光轴都与测量光轴z成θ角,且两个物镜的几何焦点重合,将该焦点作为系统原点,如图1所示。该结构中照明PSF和采集PSF将相互制约,使合成焦体体积明显减小、系统单次采样所能测量到的样品区域的大小更为精细,从而达到了提高共焦系统分辨力的目的。理论上,当两个光轴正交时,系统的合成焦体体积最小,可形成一个近乎球形的焦体[1]。
1.2 双轴结构的点扩散函数和空间分辨力
上述双轴结构对共焦系统空间分辨力的改善还可以通过基于旁轴近似的衍射理论来进行推导。如图1所示,系统坐标为(x, y, z),照明光路坐标为(xi, yi, zi)和采集光路坐标为(xc, yc, zc)。三个坐标系之间的转换关系可表示为[2,3]
设系统为均匀照明,照明光源波长为λ,对于位于空气中的反射系统(n=1),反射进入采集光路的光波波长并不发生改变。则照明PSF和采集PSF分别为[3,6]
式中J0是零阶贝塞尔函数;ρi、ρc分别是IL和CL的归一化径向半径;vi、ui和vc、uc分别是IL和CL的归一化光学坐标。
式(2)和式(3)中的指数项表示IL或CL的PSF的轴向焦深。由于系统采用中低数值孔径物镜,其PSF的轴向焦深要远大于横向宽度。因此在讨论双轴共焦显微系统焦点附近的光强响应时,该指数项可以忽略[2,3],即双轴共焦显微系统的光强响应函数近似为
其中,式(4)采用的近似在θ接近0和90°时不适用,因为此时双轴共焦系统接近于反射式单轴共焦系统或者透射式单轴共焦系统,指数项对光强响应函数的影响不能忽略,因此上述近似将不再成立。考虑到指数项的影响,以及θ角过小给实际构建系统带来的困难,可以限定θ的范围为10°<θ<80°。
对于一个对称的双轴系统,IL和CL的参数相同,利用数值计算,由式(1)至(4)可得出双轴共焦系统基于FWHM的横向分辨力ΔxDA,ΔyDA和轴向分辨力ΔzDA分别为[2,3]
而对于入射波长为λ、物镜数值孔径为NA的单轴共焦系统,基于FWHM的横向分辨力ΔrSA和轴向分辨力ΔzSA由下式给出[7]
由式(5)和(6)可见,双轴共焦显微系统中y轴方向的分辨力ΔyDA与单轴共焦系统的横向分辨力一致,只和光源波长λ及物镜NA有关,θ的存在对y轴方向的分辨力没有影响。而x轴方向的分辨力ΔxDA除了受到光源波长λ及物镜NA的影响以外,还受到θ角的大小的影响。且由于θ角的存在,双轴系统的x轴方向的分辨力比同等参数下的单轴共焦显微镜的横向分辨力略差,且随着θ角的增大,横向分辨力损失越大。而系统的轴向分辨力(z轴方向)ΔzDA主要由照明PSF或者采集PSF的横向宽度决定[2,3],与1/NA成正比,轴向分辨力有了明显改善,而且θ角越大,双轴结构对轴向分辨力改善得越多。
图2给出了光源波长λ及物镜NA一定时,角度和分辨力的关系,可以看出当θ角在10°至50°左右的范围内时,对z轴的分辨力的改善效果比较明显,且对应的x轴的分辨力损失不大。而当θ角大于50°时,x轴的分辨力迅速变差,造成系统的三维分辨力下降。因此在构建双轴共焦显微系统时,选取θ角在10°至50°之间可以较好地发挥双轴共焦结构对轴向分辨力的改善作用。
1.3 虚拟针孔(VPH)双轴共焦显微成像系统
虚拟针孔(VPH)双轴共焦显微成像原理如图3所示,点光源发出的光通过准直透镜L1后被照明物镜IL聚焦于被测样品表面,照明光轴与被测样品法线方向的夹角为θ。含有样品信息的测量光束被样品以θ角反射后通过采集物镜CL,被透镜L2汇聚。显微物镜MO将L2所汇聚的艾里斑放大并成像在CCD探测器上。计算机从CCD探测器上获取图像f(m,n),根据式(7)计算得到艾里斑的中心坐标O(x, y)
式中m和n是图像的像素坐标。以O(x, y)点为圆心,求出给定半径r圆域范围内像素灰度值的总和∑I (x, y),半径为r的圆域等价为实际共焦显微系统的物理针孔。通过对样品进行轴向扫描,即可获得该系统的轴向强度响应函数。
2 仿真分析与实验验证
我们搭建了如图4所示的虚拟针孔双轴共焦显微成像系统,光源采用λ=632.8nm的半导体激光器,照明物镜和采集物镜选用两个数值孔径非常接近的物镜,构成近乎对称的双轴共焦系统,其中NAi=0.117,NAc=0.106,θ=45°。所用的CCD探测器为WAT-902H Ultimate,虚拟针孔半径为3个像素,由于CCD前采用的显微物镜MO放大倍数为10倍,因此对应的物理针孔直径约为4.8μm。实验使用一个平面反射镜作为待测样品。
将NA=0.117、θ=45°代入式(5)可得该系统的理论分辨率为ΔxDA=2.83μm、ΔyDA=2.00μm、ΔzDA=2.83μm;而同等条件下由式(6)可得单轴系统的理论分辨力为ΔrSA=2.00μm和ΔzSA=57.32μm,因此,本系统的理论轴向分辨力约是同等条件单轴系统的20倍。
图5和图6为利用Matlab软件对该系统进行仿真得到的系统横向和轴向响应曲线,由曲线所得的系统分辨力与式(5)和式(6)得出的理论计算值相符。且由式(6)可知,传统的单轴共焦系统在λ=632.8nm的波长下要实现2.83μm左右的轴向分辨力,照明物镜的数值孔径NA至少要达到0.5。物镜的NA越高,引入的像差越复杂,且造成系统的工作距离迅速减小,限制了系统的应用范围。
在实际应用中,我们更关注共焦系统的轴向分辨力,因此本文只对系统的轴向响应进行了实验验证。通过平移导轨带动作为样品的平面反射镜以系统焦点为中心在轴向进行扫描,利用所搭建的实验系统测得系统的轴向响应。图7为系统轴向响应的实测曲线和理论曲线的比较,由图中可以看出,实验曲线与理论仿真曲线基本相符。实验所得的系统轴向分辨力为2.63μm,实验曲线两侧存在不对称情况。该问题可通过光学系统的严格调整和数据采样步长的合理设定来消除。
3 结 论
本文所构建的基于CCD虚拟针孔的双轴共焦显微成像系统,有以下几个优势:1)在双轴共焦结构中利用低NA物镜即可显著提高共焦显微成像系统轴向分辨力;2)低NA物镜的采用可减少复杂像差的引入,增加系统工作距离,有利于扩展共焦显微线的仿真结果与实验结果系统的应用范围,且有利于后期小型化设计;3)双轴结构可以很好的抑制旁瓣的产生,提高信噪比;4)采用虚拟针孔探测的方式,可明显降低光路调试难度,并减少由于物理针孔装调误差给系统分辨力带来的影响;5)针孔大小和形状可根据实际需求利用软件任意设定。
总之,本文对基于CCD虚拟针孔的双轴共焦技术进行了理论分析与实验验证,为后续深入研究提供了可行途径。
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收稿日期:2010-02-08;收到修改稿日期:2010-04-21 E-mail: eleanore1982@qq.com
基金项目:国家自然科学基金(60927012, 60708015)资助项目
作者简介:江琴(1982-),女,北京理工大学博士研究生,从事光电测试技术研究。
通信联系人:邱丽荣,女,北京理工大学副教授,博士,从事精密光电测试技术研究。 E-mail: qiulirong1@bit.edu.cn
