摘 要:激光扫描共焦显微术和多光子显微术等新的显微成像技术可以对厚的生物样品实现光学断层成像,因而在生物医学诊断领域具有重要的应用前境。在Fried的一维分辨度理论的基础上,系统地讨论了运用共焦扫描荧光显微术在进行光学断层成像时,其光学断层平面分辨度与信噪比之间的定量关系,建立了实际显微成像系统平面测量精度的定量计算方法。所得出的结果对于选择共焦扫描显微成像系统的最佳参数及评价所设计的显微成像系统的性能具有重要的意义。
1 引 言
分辨率和信噪比是两个十分重要的概念,特别是共焦显微技术发明以来,分辨率概念又引起了人们极大的兴趣。共焦显微术不仅具有高的横向分辨率,而且具有高的轴向分辨率,因而得到了深入的研究,并将其用来非侵入地实现对生物组织等的三维成像。然而,由于生物医学显微成像中信号十分微弱,因而获得高信噪比的信号就成为这种技术应用的关键。本文的目的就是系统地分析共焦扫描荧光显微镜分辨率与信噪比之间的定量关系。
2 基本理论
2.1 共焦扫描荧光显微镜的平面测量精度
图1为共焦扫描荧光显微镜的原理图。由激光光源发出的激光通过透镜L1射入激发小孔P,由激发小孔出射的光线经过透镜L2后成为一束平行光。该平行光线由半透半反镜M反射后,由物镜聚焦到样品中的某一点。由该点激发出来的荧光透过物镜,再透过半反镜M,由透镜L3聚焦到探测器表面前的一小孔上,从而完成样品焦面上一点的成像。光束作两维扫描便可以实现平面光学断层成像,样品z向(垂直方向)的扫描便可以使位于不同深度的样品层进入焦面(图中为简化起见,没有画出xy方向的扫描及z方向上的扫描装置)。所采集的几十层、几百层光学断层图像利用计算机软件技术便可以合成所观测样品的三维图像,供生物医学、材料科学等工作者研究。
由上可见,共焦扫描荧光显微镜在进行光学断层成像的过程中是逐点进行的,即任意两点可以独立地进行成像。系统沿一维x方向上的分辨度(Resolution scale)可以表示为[3]
分辨率δθx的意义是,将δθx除以系统的信噪比便是该系统在该噪声限制条件下的位置测量精度。由对称性和对y方向的扫描可以得出类似的公式:
式中,θ·y是光束在y方向上的扫描速度;δθy是系统在y方向上的分辨度;Gy2(0)是由系统在y方向上的传递函数决定的量,由下式定义:
2.2 共焦扫描荧光显微镜的信噪比与传递函数
共焦扫描荧光显微镜在对生物样品进行成像时,样品内信号强度近似按下式衰减[3~5]:
式(10)表明,在共焦显微术中,信号光子是由焦面体积中光的单次后向散射产生的。背景光子有两种基本的来源:(1)在焦面体积元或其附近区域中产生的单次后向散射光;(2)主要由焦面体积之外发生的多次散射光,这些多次散射光子在射出样品表面时,就好像是从焦面体积中散射的一样。在任何一种情况下,由表面探测到的背景光子数B0将随着样品的散射系数线性增长,这是因为散射系数与单位体积中的粒子数成正比的缘故。实验表明[3],所探测到的背景光子按下式衰减:
式中,dp是针孔的直径;NA是透镜的数值孔径;λ是照明波长。
式(13)中AB是衰减系数,是散射系数μs和探测针孔半径vp的函数,其值小于2;B0是聚焦到样品表面时的背景值。由式(10)和式(13)可以计算出共焦扫描显微镜的信噪比为
式中,D(x2)是探测器灵敏度的分布函数;λ1和λ2分别是入射波长和荧光波长;xs为扫描位置;d是透镜与样品之间的距离;h1是入射时物镜的振幅点响应函数;h2是探测时物镜的振幅点响应函数。
在利用点探测器的理想情况下,由式(16)可以得到共焦扫描荧光显微镜的传递函数为
式中,P是物镜的孔径函数。利用方程(8),(9),(15)和(17)便可以计算出共焦扫描荧光显微镜所能实现的测量精度。
参考文献:
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[2] D L Fried. Resolution, signal-to-noise-ratio, and measurement preci-sion, addendum[J]. J Opt Soc Am,1980, 70:748~749.
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作者简介:高万荣(1961-),男,陕西省人,南京理工大学电光学院副教授,博士(博士后),主要从事生物光子学、光电混合模式识别方面的研究。
