摘要：根据目前生物学及医学发展的需要，研制了一种在普通倒支生物显微镜下探侧极微弱细胞关光图象的高增益荧光显微镜。系统采用计算机采集关光图象，由量化标定曲线对荧光图象中的每一点根据其灰度值给出定量数据，解决了以往关光显微镜只能定性观察不能定量分析的困难。
引言
用荧光显微镜观察细胞可以得到荧光物质在细胞内的分布图象。常规荧光显微镜只能定性地得到细胞的荧光图象，不能定量地给出发光的强度数值，因而只能观察发光图象有明显变化的生理过程，而无法判断一些图象发光强度变化不大的生理过程。随着现代生物学与医学的进一步发展，对实验要求不断提高，要求荧光显微镜能给出一定精度的定量数据，以定量分析细胞内部物质分布的量值以及在生理过程中物质分布的改变.本文中提出了一种在普通国产倒置生物显微镜基础上作改进，用高灵敏度弱光成象探测器作为图象接收器的新型高增益荧光显微镜，采用CCD摄象机及图象采集卡、计算机做后极处理部分，对细胞的荧光图象进行量化处理，使通过CCD采集的荧光图象中的每一点都可根据其灰度标定曲线找到对应的发光强度值。这项工作是以往所没有的，但是在生物医学等科研实验中又是迫切需要的，因而有很高的应用价值。
1增强型荧光生物显微镜
系统框图如图1所示。光源经集光准直后透过激发滤光片产生激发光照射到细胞样品上，更换不同的激发滤光片可得到不同的激发波长，以满足不同荧光试剂的需要。细胞激发出的荧光由物镜收集后分成二路，一路进入目镜以便观察，另一路由截止滤光片滤掉杂散光只透过荧光，再经象增强器放大。仪器中采用了象增强器作为输出图象的光放大，其增益为4000。左右，这样就大大提高了仪器的灵敏度，使得仪器可以接收极弱的荧光图象，较常规荧光显微镜的探测灵敏度提高了3—4个数量级，降低了对光源及荧光标记物浓度的要求。仪器中激发光和受激荧光在同一轴上，传输方向相同。为避免激发光透过吸收滤光片到达象增强器的阴极面，将背景光放大，使荧光图象淹没在明亮的背景中，采用了暗视场照明器，并且数值孔径大于物镜的数值孔径，这样透过细胞的激发光在物镜收集的成象光锥之外，物镜收集激发出的荧光，视场中只有细胞的荧光图象及暗背景，提高了图象的信噪比。放大后的荧光图象由藕合透镜输入到CCD象面，图象采集板采集到计算机，并由计算机对输入原始图象进行处理，得到处理后的细胞荧光图象或根据标定的图象灰度数据与输入光强关系曲线得到图象中每一点的原始及修正发光强度值。
2量化处理与测试
选用由中国计量科学院标定的宽量程微光照度计KZD一I型作探测器，其光强探测范围在光源采用75W超高压汞灯，电源电压220V.暗场照明器数值孔径0.83~0.91.物镜放大倍率10倍，数值孔径0.25。激发滤光片选用ZBI有色玻璃，其中心波长在400nm左右，最大透过率为72%。截止滤光片选择的是CB58O有色玻璃，透过58Onm以上的长波部分。象增强器为国产一代三级管3XZ25/25，有效光阴极直径25mm，阴极灵敏度310拼A八m，等效背景照度电源电压6v，亮度增益40000倍.摄象机采用敏通公司的MTV一1801黑白CCD摄机，最低照度0.05lx，电源电压12V，信噪比大于46dB.断开CCD的自动增益控制，手动调节增益为一定值，不再改变。图象板为中国科学院自动化研究所生产的CA5300图象采集卡，A/D转换为loMHz，sbit，图象采集分辨率512x512，256灰度。
实验模拟均匀光入射在象增强器的光阴极面上，每组数据由计算机采集五幅取均值以尽可能减小随机噪声干扰，同时照度计读取对应的输入输出光强值。测试前光源点亮一段时间使光源趋于稳定。数据处理采用均值近似为真值，使用贝塞公式做方差估计。得原始数据如表1所示.当均匀光输入很高时，从象增强器的使用安全起见，只测到图象灰度为178，所得数据采用直线拟合效果很好。所以在179至255之间的图象灰度所对应的照度值可从直线顺延得到。
高灵敏度荧光显微镜经过性能测试后，得到了图象灰度和象增强器输出的关系，以及象增强器的输出和输入的关系，因而可得到图象灰度和细胞上发光强度的计算公式。但是照度是单位面积上的光通量，在实际应用中更多需要的是给出图象上每一点的发光强度的数值。一般细胞荧光波长人在560~600nm的范围内，为计算方便，假设在此范围内，象增强器的光阴极(S70901101多0，50170190一25)灵敏度近似为一常数。物镜及藕合透镜放大倍数为n，象增强器增益为A，输出光阑直径3lmm，照度计探头直径30mm，象增强器荧光屏与照度计距离为Zonm，荧光屏材料为p一20中短余辉光粉。图象上某点采集的数值为x，此时荧光屏上照度为取暗视觉光视效能得到细胞平面上辐射出射度与荧光屏出射光强关系如下:
根据公式(l)及表1得到以竹红君甲素为荧光试剂，细胞平面辐射出射度与图象采集数据关系曲线如图2所示，采用直线M(me)~0.143x一8.35拟合，效果很好.
3讨论
在测量过程中，影响测量的因素是多方面的，主要集中在下面几个方面:
1.象增强器是整个仪器的核心，其作用是把微弱的荧光图象增强到足够的亮度以供人眼观察或CcD采集。对象增强器主要要求是:
l)应该有足够的亮度增益
工作在微弱光条件下，输入的光信号非常弱，这就要求象增强器要有足够的亮度增益，以便把每一个探测到的光子增强到人眼或CCD可以观察到的程度。如果增益不够大会使象管输出屏亮度降低，以致影响系统极限鉴别力。反之增益过高也会由于象管噪声加大出现闪烁现象，而使观察效果下降。通常其增益在几千到几万之间。在上述条件不变情况下，对象增强器的增益及增益线性度做测试。由于CCD灵敏度限制，非常低的输入光已无意义;从象增强的安全性考虑，过高的输入也不宜，而且实际测量中只有细胞图象的局部发光比较强，平均光强还是比较低。因此输入均匀光强的范围从亮度增益曲线如图3所示。
2)低的背景噪声
象增器由于光阴极热发射及信号感生等因素而造成附加背景噪声，这个附加噪声使荧光屏产生一背景亮度，从而使图象的对比度恶化，严重的可能使目标信息淹没于该噪声中。低的背景噪声是象增强器的基本工作条件，为保证有良好的象质，要求光阴极面上对应于暗背景亮度的等效背景亮度(EBI)值小于10-7lx数量级。实验测得在无输入光时输出光照度为2.3X10-3lx，按增益40000倍计算，其EBI值为1.02X10-3lx，满足实际需要。
3)好的象面均匀性
由于受加速电场的影响，放大率不均匀，在均匀光入射时，象增器荧光屏象面中心附近图象亮度偏大，而靠近边缘处则比较小，具有轴对称性。为保证测量的精确，需要把测量结果根据成象位置加以修正。使均匀光入射，以象面中心为CCD采集图象中心得到象面光强分布如图4所示。图中x轴为CCD采集的对应象面的象素位置，y轴为图象灰度。图象采集数据大小为512又512，对应于x轴260附近为象面的中心，数据拟合结果可用两段来表示，在230点之前，290点之后用直线拟合，中心附近用二项式拟合，非常吻合。为避免在以后数据处理繁锁，在实验中应尽可能使所要细胞图象成象于荧光屏的线性部分。实验中细胞在象面上所占面积很小，灰度差在2一3范围内，可近似相等不加修正或采用直线修正。另外象增强器的高增益会带来各种噪声，使图象标定产生影响。为测量噪声的大小，采用对象面局部点多次采样，由统计结果得到噪声方差尹=0.76，对整个测试影响不大，可在图象的预处理时用平滑方法加以消除。
2.光源的稳定性也是影响测量的一个主要因素。在光源点亮一段时间稳定后用照度计每隔一分钟测量一次光强，共测30分钟，得到光强波动曲线如图5所示，从测量结果看到光源的波动在5写范围内，对测量结果影响不大。
3.CCD采集数据由于受摄象机灵敏度、电路偏置、象增强器本底光强及噪声累积等因素的影响，在所测得。~255灰度中只有75以上数据为可靠数据，60~75之间可作为参考，60可作为图象的闭值，60以下为CCD的盲区不予考虑。
4.仪器的最小成象灵敏度:
CCD的最小成象光照度为0.05lx，在上面所讨论条件下可求得象增强器光阴极的最小成象光照度为:
细胞平面上的最小辐射出射度:
取荧光波长几~560nm(竹红君甲素的荧光峰值)，激发滤波片的透过率取0.9。计算得到
5.误差分析:
在整个测试系统中，误差来源是多方面的，有光源的稳定性误差，增益的线性误差，CCD的线性误差，二次仪表的误差及光出射度到辐射出射度转换时光谱近似误差等。如果不考虑最后一项，设其它各项间协方差为零，在置信概率0.95情况下整个系统的合成不确定度为d-1.35。
4结论
增强型高灵敏度荧光显微镜具有结构简单、灵敏度高和输出定量化的特点，在给出细胞芡光图象的同时，可以给出细胞上任意一点的发光强度值，用作判断细胞生理变化过程的依据。在医学与生物学研究中较普通荧光显微镜具有无法比拟的优点，定会成为人们实验与研究的得力助手。
参考文献
1张鸣平，张敬贤等.夜视系统.北京:北京理工大学出版社，1993
2汤定元，糜正瑜等.光电器件概论，上海:上海科学技术文献出版社，1989
3蔡文贵，李永远等.CcD技术及应用，北京.电子工业出版社，1992
本文作者：
曹恩华:男，1941年n月生，1965年毕业于上海医学院药化学专业.副研究员.从事生物物理研究，硕士学位导师，中国生物物理学会辐射与环境生物物理专业委员会副主任，美国光生物学学会会员，欧州光生物学会会员，中国生化学会会员.参加的核爆炸对动物远期效应获1988年中国科学院科技进步一等奖，流式荧光计研制获1992年
中国科学院科技进步奖二等奖，竹红菌甲索的光徽作用获1993年中国科学院科技进步奖三等奖。在国内、外刊物上发表80余篇论文。
许娜飞:女，1969年生，1989年毕业于上海化工学院生物化学专业，1993年毕业于中国科学院低温中心低温生物学(硕士)。研究实习员，从事生物物理研究.
李景福:男，1937年生，1962毕业千中央电视大学，高级实验师.
