摘要流式细胞仪是一种对细胞进行定童分析与分选的精密仪器，它分析速度快、特异性好和灵敏度高，是生物医学研究的强有力工具。本文在自己研制的流式细胞仪的基础上，结合国内外的最新动态，概述了该领域在仪器和技术方面的最新发展及其在生物医学研究中的应用。
前言
流式细胞仪是集光学、电子学、流体动力学和计算技术于一体的大型精密仪器，是一种进行细胞快速定量分析与分选的现代生物医学仪器。随着光机电和计算技术以及单克隆抗体、细胞化学和免疫化学等学科的发展，流式细胞分析技术发展迅速，在传统的流式细胞仪的基础上又增加了许多新的配置和新功能。仪器具有更高的灵敏度、分辨率和更宽的激发波长范围，已成为生物学和医学研究的重要工具。我们自主研制成多参数流式细胞仪后[1〕，又开展了仪器的功能开发和新型流式细胞仪的研制工作以及在细胞凋亡中的应用研究(2、3)。近年来流式细胞仪的发展迅速，应用越来越广，为了进一步推动流式细胞分析技术在国内的开展，本文结合我们多年来在该领域的工作及国内外的进展情况，概述了流式细胞仪的最新发展及在生物医学中的应用。
2仪器技术的发展
2.1提高仪器灵敏度和分辨率
流式细胞仪由于采用石英流动室和大数值孔径物镜，使收集到的细胞荧光信号大大增强;同时采用高灵敏的光电探测线路，大大提高了流式细胞仪的测量灵敏度，可以分析更微弱的荧光信号。目前只要样品上标有100个FITC或PE分子，仪器就能检测到，这个光信号已远低于大多数生物细胞自发荧光的强度。由于灵敏度的提高，现在许多流式细胞仪不必使用水冷却的大功率激光器，而只用15mw的小型气冷激光器，就能够获得很好的实验结果，且使得仪器体积减小，造价也大为降低。
随着光电检测、液流系统和数据处理系统的发展，流式细胞仪具有更高的分辨率，可以获得CV值(变异系数)很小的实验结果，使得高分辨率的染色体的分析和分选成为可能。利用前向小角散射与荧光检测可以进行细菌、酵母菌以及其它直径小至0. 14微米的微小颗粒的研究。图1为染色体的双参数三维立体点图。染色体由荧光标记物CA3和HOECHST进行双标记，然后用流式细胞仪进行测定。进行染色体的分析，需要仪器有很高的分辨率。以往由于仪器分辨率不够高，很难把各个染色体都区分开。现在不仅能把各个染色体很清楚地显示出来，还能根据需要，把某几个染色体分选到不同的容器内。
2.2扩大使用范围
普通的流式细胞仪只具有488nm和514 . Snm等少数几个特定的波长，而使用染料激光器后可获得连续可调的光谱，扩大了波长范围，可以满足用户许多特殊的研究需求。通过配置多个激光器，还可获得从紫外到近红外等不同的激发波长，可用于Hoechst33342, Furs一2,indo一1, DAPI, APC等荧光标记物的测定。
2.3提高分析速度
流式细胞仪的特色之一，是它可对细胞进行快速定量分析，每秒钟可分析几千个细胞。而现在由于采用了高速的数据处理系统和高效的液流控制系统，又大大提高了流式细胞仪的分析速度，目前最高可达60000个/秒，即每分钟可分析三百六十万个细胞。而为了获得更好的CV值，一般情况下应把分析速度选择在较低的范围内，如每秒几千个左右，即每分钟几万至几十万个。这是以往用细胞荧光分光光度计一个一个地测定细胞，每分钟最多分析几十个细胞无法比拟的。
2.4实现多色荧光分析
流式细胞仪的另一个重要特色是它可对细胞进行多参数测定，即用多种标记物同时对细胞进行标记。通过测定细胞的多色荧光，一次实验就能同时测得细胞内多种成分的含量。但荧光标记物大多具有较宽的发射光谱，用几种不同的标记物标记细胞后，不同探测器探测到的荧光信号常有重叠，为了得到更准确的结果，必须进行荧光补偿。目前有两种荧光补偿方法。一种是用电路硬件，即用线性荧光补偿电路和对数放大电路进行荧光补偿，这种方法只能做到部分补偿，而且这种方法对仪器的调节要求较高，用户有时难于掌握好。另一种方法是用软件完成荧光补偿，即采用高分辨率的模数转换电路和相应的软件系统替代线性荧光补偿电路和对数放大电路。这种设计有两个特点:第一，可以更有效地捕捉到每个细胞所发出的荧光信号;第二，可以排除自发荧光的干扰，这种荧光补偿方法能够做到在整个检测范围内进行完全的荧光补偿，使多色荧光分析获得最佳的结果，这是单纯用电路硬件进行荧光补偿无法做到的〔4]。
最近还有一种实现多色荧光分析的方法，即用立体激发系统:使用多根激光束分别激发每一个细胞，再用不同的光电探测器检测细胞的荧光信号。这样就避免了不同激光激发的荧光信号之间的相互影响和由于细胞荧光信号重叠导致的补偿困难，使多色荧光分析达到最好的效果，成功实现样品的多色分析。目前最多可进行八色荧光分析和前向及侧向散射光分析，即在一次实验中，可同时获得细胞的1}个参数，可同时获得细胞大量相关的信息。
2.5改进分选功能
流式细胞分选功能是流式细胞仪的一个很重要的方面[Ls,6l，利用分选功能可获得某一类细胞并进行培养，以供进一步的研究。以往的流式细胞仪在分选操作上比较复杂，主要是延时时间的设置很麻烦，而延时时间是分选中一个最重要的仪器参数，直接影响分选结果。使用者只能设置不同的延时时间，通过多次试验再找出最佳延时时间，这样做既浪费了许多时间和样品，也不能获得最满意的结果。新型流式细胞仪由于采用了许多独特的设计，如通过配置CCD相机和相应的光学照明系统及数据处理和控制电路，及时处理高速液流和液滴的图像，再由图像处理的结果自动计算和随时调整分选延时时间等参数，得到最佳分选结果。还可自动计算测量的目标细胞数和被分选出来的目标细胞数，实时显示分选收获率。新的设计使得分选操作简单易行，而且在获得很高分选速度(最高可达2500()个/秒)的同时，还保证了最大的分选纯度和回收率。
2.6软件的发展
与流式细胞仪硬件的快速发展相比，进展更快的当属流式细胞仪分析软件，现已开发了各种软件，如全自动细胞DNA分析软件、多色荧光自动分析软件和高速分选及点对点分选软件等。流式细胞仪的图形分析软件也有进一步的发展，一次实验能给出各种直方图、二维点图或等高图、密度图和三维立体图等。可在三维空间显示细胞各种参数之间的关系，为流式细胞分析提供更全面的视角，更充分地发挥流式细胞仪多参数测量的优点。
2.7仪器的自动化
以往流式细胞仪的使用比较麻烦，非专业人员很难把仪器参数调整好，要得到最佳CV值需要花上不少时间，对于经验不足的使用人员甚至很难把仪器调整到最佳状态。现在很多小型流式细胞仪都实现了仪器参数的自动调整与补偿。有的仪器还具有自动控制程序，仪器一开机，通过自检，就处于最佳工作状态。仪器可完成标本自动进样、标定和分析，使用十分方便。有的仪器还具有全自动质控程序，有自动跟踪调节功能，可实现质控过程自动化，进行质控数据比较，给出质控曲线与数据，最大限度减少人为因素造成的偏差。还可进行实验室联网，实现与其它实验室实验数据的资源共享。
2.8提高分析精度
通过脉冲处理技术，能识别、区分和有效去除样品中粘连的细胞、聚集体和碎片等，采用标准荧光微球和软件处理提供可靠的质量控制及质量保证系统，以排除各种影响因素的干扰，最大限度地减少假阳性率，使实验结果更准确可靠。
3应用
流式细胞仪可对细胞(或生物颗粒)的理化及生物学特性，包括细胞大小，DNA含量，细胞表面抗原表达等进行快速多参数定量分析与分选。随着各种新的荧光染料及单克隆抗体的开发和应用，进一步扩展了流式细胞仪在生物学和医学领域的应用范围。
3.1在生物学的应用
流式细胞仪在细胞生物学、细胞遗传学、分子生物学、神经生物学、微生物学、植物学和海洋生物学等许多学科以及在细胞凋亡、细胞周期调控、细胞因子、信号传导、细胞内pH、细胞膜电位、细胞内钙浓度的检测和细胞各种动力学过程等许多领域得到越来越多的应用。下面仅就流式细胞仪在生物学方面目前用的最多的细胞凋亡做一简要介绍。
细胞凋亡是生物体生长发育过程中普遍存在的现象，它是为了维持细胞内环境的稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。关于细胞凋亡的研究，已成为医学和生物学研究的一个热点。近年来，每年都有近万篇这方面的研究论文为SCI收录。关于细胞凋亡发生机制和临床应用的深入研究，将加深人们对生命现象的认识，和导致治疗白血病，艾滋病，神经性疾病和癌症等疾病的新药物和新疗法的出现。流式细胞仪的发展为深入研究细胞凋亡的机制带来新的动力，是细胞凋亡研究中十分有用和可靠的工具。目前用于研究细胞凋亡的方法主要是光学和电子显微镜法、琼脂糖凝胶电泳法、酶联免疫分析法、末端标记法和流式细胞分析法。与其它方法相比，流式细胞分析法具有定量研究的优点，可以进行细胞的多参数关联测量，同时对凋亡细胞进行功能性和形态学研究。流式细胞仪与末端标记法结合，还具有很高的测量灵敏度，可分析处于凋亡早期的细胞，用荧光染料HO和PI染色，并和细胞光散射测定结合起来，是目前令人满意的细胞凋亡形态学分析方法，同时也适合于不发生DNA断裂的凋亡细胞的测定[v]。DNA直方图上是否出现亚二倍体峰，在流式细胞分析中常作为是否发生了细胞凋亡的判据。但在细胞凋亡早期有时没有亚二倍体峰或不明显，这时用HO和PI作流式荧光双染色分析可以把凋亡和非凋亡细胞比较清楚地分开。流式细胞分析是研究辐射、化疗和药物是否导致细胞凋亡的很有用手段。图2为HL一60细胞DNA含量直方图。图2A为对照(未处理)，图2B为用100ug/ml的GeNIstein ( GEN)处理4小时后的直方图。G1为DNA合成前期，S为DNA合成期，G2为DNA合成后期，M为有丝分裂期，Ap为凋亡细胞。由图显示，经GEN处理后的细胞发生了凋亡，并且各个周期的细胞百分比也发生了明显的变化(8).
3.2在医学的应用
肿瘤学:流式细胞仪被广泛应用于肿瘤的诊断分析、预后判定和治疗方案的设计f9l。恶性肿瘤的早期诊断是提高治愈率和生存率的关健，良恶性肿瘤的鉴别诊断对于确定临床治疗方案具有决定性的作用〔10〕。流式细胞仪通过对细胞DNA含量分析，根据其细胞周期是否出现非整倍体细胞峰，或虽然未出现明显的异倍体，但细胞周期中场G1 S和q等各期的比例出现异常，也可较为准确地判定其是否癌变。流式细胞仪可用于恶性淋巴瘤、皮肤肿瘤、骨肿瘤、脑肿瘤、妇科肿瘤等多种肿瘤的诊断分析。流式细胞仪以其快速、精确和多参数测定给肿瘤的病理学诊断带来了飞跃，为肿瘤的早期诊断和鉴别诊断提供客观而准确的资料〔11-13〕。
血液学:流式细胞仪在血液学中的应用发展更加迅速，流式细胞仪要求标本是细胞悬液，而血中的细胞成份在生理状态下是分散的游离状态，所以它最适
用于流式细胞仪测定。图3为白细胞的双参数分析图。使用一种高集成度经济实用的微型流式细胞仪(白细胞五分类血液分析仪Pentra 60 )，采用光吸收技术和电阻抗法(体积)对流过的每一个细胞进行检测，可以把白血病中的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨大不成熟细胞、淋巴细胞、异常淋巴细胞和单核细胞清楚地区分并显示出来。白血病细胞免疫分型是诊断恶性肿瘤的重要标准，而流式细胞仪能快速、多参数的测定白血病细胞的细胞膜、细胞浆和细胞核的免疫表型，了解被测白血病细胞所属的细胞系列及其分化程度，对白血病的诊断、分型和治疗方案选择与预后判断有重要意义。流式细胞仪能快速准确地分析血液、骨髓和白细胞中造血干/祖细胞的总数及亚群数，对血液病，恶性肿瘤和基因异常等疾病的造血干/祖细胞的移植治疗有重要价值。另外流式细胞仪还可用于血小板病和红细胞疾病的诊断等。
免疫学:流式细胞仪也用于免疫学基础研究和临床医学的各个方面〔i4l，对疾病的诊断，治疗和预后评价起了重要的作用，它与单克隆抗体结合可用于免疫分型、分选及机体免疫状态的监测等，高度特异性的各种各样的单克隆抗体的出现，极大地推动了流式细胞仪的发展，将流式细胞定量技术与免疫学方法结合起来，进行细胞表面抗原，癌基因抗原等的检测，在肿瘤诊断，单克隆抗体的筛选，癌基因表达与肿瘤生物学特性等方面的研究，取得了许多可喜的成果。
参考文献
[1]林波海，吴维，曹绍启等.流式细胞计的研制.生物物理学报，1992, s(1): 81一s5
[2〕林波海，周宏伟，吴维等，流式细胞仪功能开发.现代科学仪器， 1998,(4):21一22
[3」徐滨，林波海，吴维等.新型多功能流式细胞仪的研制.生物物理学 报，1998,14(3):558一564
【4] Shapiro HM, Practical flow cytorttehy, 3rd ed.，New York: Whey-Ides, 1995, 166 - 215
【5〕周宏伟，林波海，吴维等.流式细胞分选装置的研制与发展.生物 物理学报，1997,13 (3),512一518
[6] Zhou HW, Lin BH, Wu W,‘Ql. A Low-voltage Ihnplet Charging Circuit With Simulative Cell-sorting Function for Flow Cytortteter-cell Sorter.价- tometry, 2000, 39: 306一309
【7」赵卫红，寿好长，闻福岭.细胞凋亡.第1版.郑州:河南医科大学出 版社，1997,195、201
[8] I)arzynkiewicz Z et al. Features‘Apoptotic Cells Meaaurod场Flow伪- tmretry. Cytometry,1992,13:795一808
[9」谢锦玉.现代细胞化学技术及其在中西医药中的应用第1版，北 京:中医古籍出版社，1998, 9}4一101
[10」左连富.流式细胞术与生物医学.第1版.沈阳:辽宁科学技术出版社，1996,199一239
【11】G}rrezMamano C, Fueyo J, Alerneda F, et ad.Geate Therapy for Gliomas: p53 and E2F-1 Pmteins and the Target of Apoptosis. Intemation-al Jarrnal of Molecular Medicine, 1999 , 3 (1) ; 81一85
【12】康山，李瑛，张辉等肿瘤浸润淋巴细胞诱导的卵巢痛细胞凋亡与 6e1-2基因的关系.中华新医学，2001,2(3):218 } 219
[13]齐凤英，段惠军，刘庆银等.流式细胞术检测胃癌前病变DNA及 P21,P53含量生物化学与生物物理进展，1998,25(4):363-.366
[14] Ahem AL and Melnick SJ. Qinical Application‘Four and Five-color Flow Cytor}}etry Ly}hOCyte Subset I
本文作者：林波海周宏伟吴维王丽华
