摘 要 根据BACTEC-960仪分析动物试验模型主要脏器的结核分枝杆菌生长情况,分析结核分枝杆菌MPT64和ESAT6 DNA疫苗预防结核病的效力。将BALB/C小鼠随机分五组,分别用A组生理盐水、B组载体质粒、C组卡介苗、D组重组质粒JW4303-MPT64DNA、E组JW4303-ESAT6DNA免疫9周后,用H37RV结核分枝杆菌强毒株攻击小鼠。观察攻击一个月和两个月后的结果。发现C,D,E组比B组生长天数总体向后推迟,生长时间明显集中,生长曲峰强度比B组明显减弱,C组肝脏中的感染率比D,E组有所下降。D组肺脏中感染率下降明显。D,E组鼠脾淋巴细胞转化率较C组高,B明显降低。结论:与B组比,小鼠免疫力的短期预防有所增强,其中卡介苗前期效果明显;MPT64,ESAT6是持续效果好。
为探索结核病控制的新途径,利BACTECMGIT 960仪器分析动物实验模型主要脏器的结核分枝杆菌(MT)生长情况,以观察MT的MPT64,ESAT6质粒DNA疫苗预防结核病的效力。
1 材料与方法
1·1 材料
1·1·1 实验动物BALB/C小鼠由北京药检所动物中心提供。
1·1·2 MT强毒株(H37RV)由中国药品生物制品鉴定所提供。
1·1·3 质粒JW4303-MPT64和JW4303-ESAT
6重组表达质粒,宿主菌大肠杆菌DH5a由本院研究室提供,卡介苗由成都生物制品研究所提供。
1·1·4 BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪及其相关试剂由美国BD提供。传统培养基(7H10)由本室自制。
2 实验方法
6~8周龄雌性的BALB/C小鼠38只(购于北京药检所动物中心),分为五组。A组6只,双侧胫前肌各注射生理盐水0·1ML; B组6只,缓慢注射50ug/50ul载体质粒;C组6只,注射卡介苗0·1ML;D组10只,缓慢注射50ug/50ul重组质粒JW4303-MPT64 DNA;E组10只,注射重组质粒JW4303-ESAT6 DNA(方法同上)除C组外,其他四组分别于0,3,6周各免疫3次。
用H37RV MT强毒株(5×106CFU/ML)在9周时攻击小鼠。每只注射0·5ml于小鼠腹腔内。攻击一个月后,将每组前3只小鼠杀死。用75%乙醇浸泡小鼠20分钟,开腹取出肺、肝、脾。用无菌生理盐水冲洗,然后放入组织研磨器内研磨。
取研磨好的组织悬液0·1ml加入到0·9ml生理盐水中混匀,取0·1ml接种于7H10培养管中进行普通培养,30天时进行菌落记数。同时,取0·5ml接种于BACTEC MGIT 7H9培养管中,加入0·8ml添加剂,放入BACTEC MGIT 960培养仪内进行培养,每日观察培养结果,需培养42天后方可发出阴性结果。各组剩余的小鼠被攻击两个月后,将其全部杀死,重复上述操作步骤。
淋巴细胞转化试验。取小鼠脾研磨好的组织悬液,加入淋巴细胞分离液,离心后,吸取淋巴细胞层,与适度PHA混合,置37℃培养72小时。取培养的淋巴细胞涂片,染色、镜检。根据细胞大小、核与胞质的比例、胞质的染色性质和核结构以及有无核仁等情况,分别计数转化细胞(包栝大淋巴细胞、过渡型母细胞、核丝分裂相细胞)和小淋巴细胞,以百分率报之。
3 统计学方法
在进行淋巴细胞转化试验时,我们采用对比试验的统计试验方法。采用的统计量为
4 结 果
MT H37RV强毒株攻击一个月的小鼠肺、脾、肝培养结果:样本最快检出时间为6天,90%阳性样本检出时间为7~13天,最迟检出时间为40天,41~42天均无阳性样本检出。小鼠肺、脾、肝用BACTEC-960培养的每天GI(生长指数)平均值如图1所示。手工培养30天报告培养结果。A,B,C,D,E组的淋巴细胞转化率(%)平均值分别为54·2%;52·7%;
53·8%;60·5%;56·3%。其中D,E组转化率明显高于B组。攻击两个月的小鼠肺、脾、肝的培养结果,样本最快检出时间为5天,90%阳性样本检出时间为10~15天,最迟检出时间为30天,31~42天均无阳性样本检出。小鼠肺、脾、肝用BACTEC 960培养的每天GI平均值如见图2所示。A,B,C,D,E组的淋巴细胞转化率(%)平均值分别为46%;46·6%;54%;63%;59·83%。其中,C,D,E组明显高于B。
两个月生长指数(GI)值比较,肺和肝数值明显降低(见图1),差异显箸(P<0·05)。小鼠脾的数值变化不明显。普通培养记数结果与BACTEC-960分析的结果相近(见表2)。除A-1和D-1有升高外,其他项均降低。第二个月的淋巴细胞转化率(%)平均值明显高于第一个月(见表1),以D组为最高。
5 分 析
国际已有证明了结核病的DNA免疫可表达和传递蛋白抗原,诱导机体产生细胞和体液免疫应答,对分枝杆菌产生保护性免疫[2~4],而国内尚无报导。为探索结核病控制的新途径,利用BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪进行动物实验模型分析[5],以观察MT的MPT64,ESAT6质粒DNA疫苗的保护效力。
BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪[1]通过MGIT培养管的底部包埋有荧光指示剂,荧光指示剂对溶解于培养基内的氧气高度敏感。培养初期,大量的可溶性氧分子抑制荧光指示剂释放荧光,当MT生长时呼吸消耗大量的氧气,使这些荧光指示剂释放荧光。BACTEC MGIT 960荧光强度记忆探测器每隔60分钟连续测定培养管内的荧光强度,通过数据处理判断是否为阳性,以生长指数(GI)形式报告结果。
分枝杆菌的抗原既有共同抗原又有种的特异性抗原,其抗原总数多达100种以上。保护性抗原是种特异性抗原的决定簇,还是共同抗原的决定簇,或者二者兼备尚在研究中。在MT的免疫应答中,哪一种抗原占主导地位、起主要作用就必须借助动物试验进行细致的研究。DNA疫苗的作用原理是使外源基因在真核细胞内表达,表达的蛋白抗原和MHC I类分子结合后,被送到细胞表面,再被CD8+T淋巴细胞的受体识别而诱发CTL的细胞毒反应,这对细胞内寄生的分枝杆菌有很大的杀伤作用。MPT64,ESAT6质粒DNA都是分枝杆菌复合群主要的分泌性蛋白质,也是其重要的T细胞抗原。本研究将上述两种DNA疫苗免疫小鼠,用以观察小鼠的体液免疫和细胞免疫应答,并通过试验评价这两种DNA疫苗的保护作用。
我院利用BACTEC 960全自动分枝杆菌培养仪进行动物试验模型主要脏器的MT生长情况,研究资料显示上述两种DNA疫苗在小动物试验的预防过程中是有效的。DNA组细菌计数下降率比载体对照组(B)明显。第二个月比第一个月培养时间明显向后推迟且集中。同时,第二个月曲峰强度也比第一个月明显减弱,可能说明小鼠经DNA疫苗刺激后,免疫力增强,使MT生长受抑制和生长速度减慢。普通培养记数结果与BACTEC-960分析的结果相近(见表2)。
据Kamath报道[2]用呼吸道气雾攻击小鼠4周时,MPT64DNA疫苗可使肺部MT菌落数比载体对照减少0·38log10,与本试验相同,但试验中也反应出小鼠个体生长指数差异明显,从各组间分析,小鼠肺和肝GI值均有不同程度的下降,以D组最明显,淋巴细胞转化率也证明了这一点。说明D组的重组质粒JW4303-MPT64保护力优于E组ESAT6质粒DNA疫苗的保护效力。C组卡介苗第一个月预防效力比第二个月强,证明卡介苗保护效力好,但随时间的延长,此作用开始减弱。小鼠脾的计数无规律,可能与对MT不敏感有关。
迄今为止,未见有关BACTEC-960检测动物试验模型评价DNA疫苗的保护力的报道。通过试验摸索,将动物模型的组织液稀释10倍以上进行培养为宜,以达到仪器培养计数的最佳效果。第一组阳性样本培养的时间最长为40天,第二组为30天,故仪器分枝杆菌培养时间周期定为42天较合适。BACTEC960全自动分枝杆菌培养仪能计算出详细的生长指数,与手工计数趋同,且第二组最快生长时间为5~6天,还能观察第二组小鼠经DNA疫苗刺激后,生长密度和曲峰强度不同(见图1),为试验工作提供快速、详细、精确的报告。
参考文献
[1] LeoNId B Heifets. Rapid Automated Methods (BACTEC system) inClinical Mycobacteriolgy. Semin Respir infect. 1986,1:242
[2] Kamath AT, Feng CG, Macdonald M,et al. Differential Protec-tive Efficacy of DNA Vaccines Expressing Secreted Proteins of My-cobacterium Teberculosis. Infect Immun, 1999,67:1702~1707
[3] Huygen K, et al. Immunogenicity and Protective Efficacy of a Tu-berculosis DNA Vaccine. Nar Med, 1996,218:857~859
[4] Lozes E, Huygen K, ContentJ,et al. Immunogeni-City and Effi-cacy of a Tuberculosis DNA Vaccine EnCODing the Components ofthe secreted Anegen 85 Complex. Vaccine, 1997,15(8):830~833
[5] 李洪敏,吴雪琼,王巍.新型BACTEC MGIT 960全国动快速分技杆菌首培养鉴定药敏仪及其应用.现代科学仪器,2000,2:61
本文作者：李洪敏 吴雪琼 金关甫 史迎昌 由昆 郑忠国 梁建琴 阿布杜
