摘要:本文报导所研制的一种新型的涉及化学动力学的测试仪器,适用于果蔬农药残留毒性的单一性测试。本文阐述根据农药对人体的毒理学机制所进行的仪器设计是利用光电传感—微电脑系统,通过比较催化显色反应的动力学曲线来确定果蔬中的农药残留水平的工作原理;以及满足设计要求的关键技术。仪器以“酶抑制率”来衡量农药残毒对人体的毒性大小。本仪器测定速度快(1min),试剂费用低廉,本仪器的灵敏度:敌敌畏≤0·3μg/mL,甲胺磷≤1·5μg/mL。
由于水果、蔬菜等绿色食品施用的有机磷、氨基甲酸酯类农药对人体的乙酰胆碱酯酶的活性起着抑制作用,严重影响人体健康,所以对果蔬的农药残留毒性需要测试并加以控制。基于显色反应的酶抑制法快速检测农药残留毒性从50年代开始陆续有报道,但由于都是采用直接目视的酶抑制反应单点显色比色法[1][2][3],无法克服由于酶试剂活性的变化,反应所处的环境温度的变化,反应时间控制的不够精确,不同果蔬背景颜色的差异等诸多因素的影响,故测试结果不够理想。本文报道研究出新型的基本酶抑制显色反应的涉及化学动力学的测试仪器,适用于果蔬农药残留毒性的单一性测试。
1 方法原理
1·1 有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂的毒理不原理:这两类农药共同毒理机制为抑制人体乙酰胆碱酯酶(AchE)的活性,乙酰胆碱酯酶(AchE)对神经传递介质乙酰胆碱(Ach)有如下的催化反应:
当农药抑制了乙酰胆碱酯酶的活性,就会造成乙酰胆碱的积累,影响正常的神经传导,引起神经中毒。一般认为当体血液中乙酰胆碱酯酶的活性被抑制30%左右就会出现中度中毒症状,当乙酰胆碱酯酶的活性降到50%左右即出现迷等严重中毒症状[4][5]。
1·2 农药残留毒性的检测原理:将敏感酶源中获取的乙酰胆碱酯酶作为目标物,设计下列反应来测定果蔬中的农药残留对乙酰胆碱酯酶的抑制程度(毒性)。
1·2·1 采用敏感酶源的乙酰胆碱酯酶为催化剂,催化碘化乙酰硫代胆碱的水解反应。
1·2·3 于410nm特征波长处测定吸光度的变化曲线,并按下式求出乙酰胆碱酯酶的催化活度。
上式中 A:一定量的乙酰胆碱酯酶催化显色反应的吸光度随时间变化的直线斜率
B:乙酰胆碱酯酶受农药抑制后催化显色反应的吸光度随时间变化的直线斜率
1·3 仪器的设计原理:模拟了人体中毒过程的原理,测定果蔬样品中的农药残留对乙酰胆碱酯酶活性的抑制程度。测定由微电脑比较样品与乙酰胆碱酯酶作用后催化显色反应的动力学曲线,通过计算确定样品中的农药残留水平。
2 仪器的组成结构
本仪器主要由稳压电路、光源、样品池、光敏接收器、信号处理电路、显示器、打印机等部分构成,结构框图如图1所示。
2·1 灯电源电路的选择
稳定发光的光源是仪器稳定工作的先决条件,光源灯电源电路的性能好坏直接关系到仪器工作时的噪声及漂移等整机的关键性技术指标。由于本仪器选用了不同于一般分析仪器上所常见的光源灯,根据该灯的技术特性,我们尝试了三种类型的电路:倍压整流起辉的AC/DC变换器供电电路;DC/DC变换器反激式自激振荡脉冲电源电路;DC/DC变换器反激式自激振荡脉冲电源电路。择优选定了特种自适应AC/AC变压器方案,它具有电路形式简单,工作可靠,能自动对光源灯的工作状况进行适应性调整,从而可获得高稳定的灯电源供给。其不足之处在于对变压器有较高的技术要求,电源变换效率较低,并有一定的低频电磁辐射泄漏;采用本电源电路并对其它单元电路进行改进优化处理后解决了抗干扰问题。
2·2 光学系统的确定
2·2·1 单光路光学系统具有较高的能量输出,有利于提高最终检测结果的信噪比,有利于克服杂散光等因素对仪器性能造成的不利影响,这种结构可以简化仪器构造,降低制造成本;而双光束光路系统具有较强的抗干扰能力,能提高仪器对电源波动的适应性,缩短仪器的预热稳定时间。由于本仪器用于现场快速测定,使用时通常不宜进行长时间的预热稳定,对电源的不稳定性要求有较好的适应能力。故决定采用双光束光路结构。
2·2·2 为了提高检测元件接收的有效光能,而又不希望选用电路复杂,散热要求高,体积较大的高功率光源灯,我们选用了特种辉光放电灯,该灯具有较小的自身体积,经采取适当措施后散热体积也可做得很小。它所具有的较特殊的光谱能量辐射特性,特别适合于在本仪器的双光束光路系统中采用,选用该灯可使本仪器的光路系统省去传统双光束分析仪器中的分光器,不但简化了仪器的整体设计还能避免由此产生的光能损失。此外,该灯的光谱能量分布为离散性的线状光谱而不同于分光光度计中常用的连续光源,它在仪器选用的检测波长上具有较强的能量输出,而在检测波长以外的附近却没有强的干扰谱带存在。我们采用窄带滤光器获得所需的单色光源,这就为仪器的小型化创造了另一十分有利的条件。
2·2·3 为了减少众多光学元件折反射所产生的光能损失和杂散光干扰,我们一直遵循着简单实用的设计方针,采用圆形样品池是这一设计思想的主要体现。在光路中采用圆形样品池可以起到凸透镜的聚光作用[7],从而增加光电元件的受光通量,提高整机信噪比并减小杂散光对检测动态范围的影响。但是采用圆形样品池聚光,其凸透镜的焦距是随样品不同而变化的,且加工曲率及壁厚均匀的圆形池还存在工艺上的困难。因此,在一般的UV/VIS分析中尚未见到圆形样品池的采用。由于本仪器采用了酶动力学的分析原理,圆形样品池在实际操作中的定位误差及样品介质的折射率变化和池结构本身的任何不均匀性等影响因素均在仪器的信号变换及运算电路中转化为待测曲线的截距变化而不影响最终测定。因此,圆形样品池的采用是本仪器进行光路优化及紧凑设计的基础。
2·3 检测元件的选择
本仪器要求检测元件在使用光谱带宽内的检测灵敏度高、线性范围宽、噪声水平低(或暗电流小)、漂移小,同时与之配套的电路简单、安装调试容易、可靠性高、故障率低、寿命长、不需特别维护,重量轻、体积小,为适应现场使用还须对震动冲击有一定的耐受力。
比较了光电管、光电倍增管及半导体光电器件。由于半导体光电探测器的体积小,又不需另设负电压电路,有明显的优势,因此我们挑选了一种新型半导体检测器,并以零偏置光伏方式应用,配以适当的前置放大器以获得足够的灵敏度和最大的线性工作范围。
2·4 前置放大器的确定
为了满足半导体光电检测器对零偏置光伏模式的运行要求,放大器设计成低噪音低漂移的电流-电压转换电路,为防止光源灯工作时产生的电磁干扰影响放大器的正常工作,本放大器加入了抗干扰电路并采取了屏蔽措施。
2·5 信号变换及运算电路
从前置放大器送来的信号除含有待测信号外,还含有圆形样品池不均匀性及定位误差等前已述及的诸多因素的干扰成份,并且它的量值关系是非线性的。信号变换电路的作用就是要在这样的复合信号中提取出有用信号并将它转变为线性的量值关系,然后计算出测定值,显示并打印输出。单片机数字化电路具有较强的抗干扰能力,并可通过修改软件对仪器性能作一些补充或调整,解决硬件难以解决的问题,如零点漂移、温度补偿等,并可简化硬件电路。本仪器使用了硬件信号变换软件运算求值并显示打印的方案。
3 仪器的功能与应用
3·1 本仪器用于果蔬中的农药残留毒性的的测试须经过如下步骤:
3·1·1 制样方法:取2g剪碎的蔬菜样品放入提取瓶中,加入6mL提取液,盖了瓶塞,振荡提取2min后取清液为待测液。
3·1·2 对照测试:在专用的反应瓶中依次加入一定量酶液,提取液,显色剂和底物,摇匀后立即移入样品池,上机测定。
3·1·3 样品测试:在专用的反应瓶中依次加入一定量酶液,样品液,混匀静置5min后,加入适量显色剂和底物,摇匀后立即移入样品池,上机测定。
3·2 仪器的主要技术指标
稳定性:漂移±5个字/h;重复性:RSD≤5 %;灵敏度:敌敌畏≤0·3μg/mL,甲胺磷≤1·5μg/mL。以上技术指标经福建省技术监督局计量所测试合格。
3·3 实际样品分析和比对测试
3·3·1 采用GC-MS法与本仪器速测法对蔬菜样本进行了测试,测试结果如下。
3·3·2 同时采用本仪器测定与台湾TARI法进行比较,测定结果满意。
4 结论
本仪器采用酶催化动力学光度法原理,检测果蔬中的有机磷、氨基甲酸酯类农药残留毒性。操作简易,快速,准确;仪器结构简单便于携带;已在全国12省市使用,为防止蔬菜农残中毒,收到了良好的效果。
参考文献:
[1] Archer TE, Enzymatic Methods, INAnalytieal Methodsfor Pesticides, Plant Growth Regulators & Food Addi-tives[M], Edited by Zweig, G, Volume I, 1963, Aca-demic Press, New York & London:373-379,
[2] 张莹,杨大进,方从容,农药残留量快速检测方法-农药速测卡的应用与验证[J],中国食品卫生杂志,1998,10
(2):12~14.
[3] 李治祥,黄土忠,张俊亭等:农药残毒速测箱的研制和应用[J],环境科学学报1990,10(1):101~105.
[4] 刘志民编著:现代实用毒物分析[M],北京:人民卫生出版社,1984:419~430.
[5] Mannlis S, Acetylcholinesterase of aphiscitricola [J],Pesticide Biochemistry and Physiology, 1981, 15:267~274.
[6] 刘文清,文公编著:现代实验仪器的原理与应用[M],北京:科学出版社,1998:71~128.
[7] 黄君礼,鲍治宇编著:紫外吸收光谱法及其应用[M],北京,中国科学技术出版社,1992:48.
本文作者：黄文风 蔡琪 林而立 黄敏 卢子明
