许松林 潘家普 钱水云 史桂英 卓瑞鹅 秦家楠
(上海第二医学院激光医学研究室)
激光细胞分析和分选技术已有十年的历史，但国内尚处于初试阶段.我室经过两年多努力，初步建成了一套实验装置。它与Z一80电子计算机联机使用，巳能快速分析各种生物细胞，绘出细胞数随细胞核DNA含量变化的直方图.
此方法的主要原理如图1所示.让染色细胞在稳定的液体流动中经过100微米左右的小孔，使细胞排队成行.每个细胞依次而且恒速通过激光束的椭圆形焦斑区，细胞受强激光照射后发射荧光。如果细胞核染色，则荧光与核的DNA含量成正比:如果细胞质被染色，则荧光与细胞质含量成正比;如果细胞核和细胞质分别染色，则可获得双色荧光。在与激光光轴及细胞流垂直的方向上搜集荧光，用光电倍增管接收，并进行积分放大和分类处理，在示波器、绘图仪或打印机上显示出细胞数随.DNA变化的直方图，从而快速获得各种细胞的精确统计数据，可甄别样品中细胞群体及其相对含量，探明是否存在异常细胞，可以确定细胞分裂的过程，在细胞周期分析、免疫研究、药物分析、病理诊断和计划生育等方面都有广泛的应用.
从上述原理可以推知，激光流动细胞分析系统的稳定性是此种分析方法成功的关键。有许多因素影响系统的稳定性。首先，细胞染色的均匀性是重要因素之一。同类的每个细胞亲合的染料分子必须相同;在核染色的情况下，DNA含量多的细胞亲合的染料分子应多，DNA含量少的细胞亲合的染料分子应少.染色技术必须做到亲合的染料分子数与细胞DNA含量成正比例关系.绝对避免细胞染色中染料饱和效应发生，因此染色液的浓度必须合适。
其次是激光光源的稳定性，不仅要求激光束的功率高度稳定，而且要求光场分布固定.为保证荧光脉冲为单峰，要求激光器工作在TEM00模，其光场为单一的高斯分布。
细胞流速的稳定性也是非常重要的。必须保证每个细胞通过检测区的速度相等，因为每个细胞发射的荧光光通量与细胞受照时间有关。为保证光通量只与每个细胞DNA(或细胞质)含量成正比，必须使细胞受照时间相同，也就是要求细胞流过激光束的时间相同.显然，要满足此点，细胞悬浮液的流动必须是稳定流动.无论在样品管出口或在检测区，液流必须满足稳定流动条件，即流速必须满足式中v为液流平均速率，d为管内径，p为液体密度，n为液体的粘滞系数。例如水流过100微米的毛细管时，流速应小于23米/秒才可能是稳流‘这样才能保证细胞荧光光通量与细胞DNA含量成正比。
我们设计并制成的氢离子激光流动细胞分析系统包括:细胞流动室及气压流速控制系统，稳定的氢离子激光器及光路系统，荧光检测及讯号处理系统。此外还有为准备分选细胞用的其他一些设备。
细胞流动室的外形如图2所示;它的作用使细胞排队流过检测区.室中装有内径为1毫米的金属样品管，外套内径3毫米的玻璃管，让第1鞘流流过此管，因此称第1鞘流管.样品从样品管出口流入鞘1管。在第1鞘流管的流线型出口处装有一孔径为100微米的红宝石小孔，安装时必须保证小孔平面与玻璃管轴垂直，小孔中心与管轴重合，这是流动室装配中最难而又最关键的技术。细胞流经此红宝石小孔后排队成行，然后依次进入充满第2鞘液的流动室.流动室侧壁装有二对石英小窗，其中一对是激光的入口和出口，另一对中的一栅窗作细胞荧光的出口，还有一栅作观察窗。细胞流流经流动室的检测区时，与激光束垂直相交，细胞被激光照射发射荧光。之后，细胞流与第1、2鞘流一起流经另一100微米直径红宝石小孔排出流动室，进入荷电偏转区。为保证液流稳定，安装了一套稳压系统，用一只0一10公斤/厘米2的稳压阀将.总气压稳定在3公斤/厘米2，然后分别用三只0——3公斤/厘米名的稳压阀将样品流气压、第1鞘流气压和第二鞘流气压分别稳定在1.5+公斤/厘米2，1.5-公斤/厘米2和1.3公斤/厘米2.压力差的大小对流动系统的恒定性是非常重要的，在每次实验中应保持不变.
激光器采用亚明灯泡厂YJ一800型氢离子激光管，波长4880。自制油浸通水冷却磁场线圈，以保证8小时工作而不发热，磁感强度800高斯.激光电源是自制的稳流电源，用60只大功率管控制弧光电流，并采用光反馈稳定激光器的输出功率.激光器全反镜采用棱角为34037'的镀膜水晶棱镜，激光器系统如图3所示。
为减小细胞流可能的微小飘动造成的芡光脉冲幅度的变化，用焦距分别为20厘米和2.3厘米的柱面透镜垂直放置，将激光束聚焦成200只23微米的椭圆光斑，长轴与细胞流和激光束光轴垂直，短轴与细胞流重合.当细胞流速10米/秒时，细胞荧光的积分电脉冲前沿小于5微秒.
在与激光器光轴和细胞流成900的方向上，用一焦距为10厘米的非球面透镜搜集荧光.经准直系统后投射于光电倍增管，然后由放大倍数为10的有源积分放大器大.如图4，其输出的一路送模数变换器后经Z一80电子数字计算机处理，由示波器显示或打印出细胞DNA的直方图，也可以用多道脉冲分析器显示细胞DNA的直方图:另一路送单道分析器，为细胞分选作幅度甄别;第三路送系统工作监视器，以观察系统工作是否正常.
我们用此系统测量了各种生物血细胞的DNA含量，如鸡血红细胞、蛙血红细胞，鼠的骨健细胞及白血病人的血细胞DNA分布.图6为此系统自动绘出的染色鸡、蛙混合血红细胞DNA含量的分布，鸡血峰值道数在36道，蛙血峰值道数在158道二蛙血红细胞的DNA含量是鸡血红细胞的4.4倍.由此可以定量得出细胞群体的DNA差异。图6为用鸡血红细胞和鼠骨做细胞混合样品测出的DNA分布曲线，鸡血是作定标用的.从曲线可以看到细胞在DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)的DNA含量是不相同的.不仅可定性地知道细胞处于什么期，也可以知道各期的细胞相对数量.
此分析技术在细胞研究中有广泛的应用前景，我们正进一步努力实现活细胞的快速分选，扩大这项技术的应用范围.。
