摘要 在过去的几年中，采用干血滴分析用于小分子定量的做法显著增多。在此领域的科学家们正努力寻求着一种与常规处理液体样品效果相同的方法。越来越多的相关技术已被广泛地应用于采样、储存、运输和生物样品的分析等各个方面。
近几年来，干血滴在储存、运输和外源性物质定量等方面的应用已引起了普遍的关注[1-8]。这项技术的发明归功于Guthrie，是Guthrie1960年在一个检测苯丙酮尿的实验中开发出来的[9]。这个实验将在特种纸上收集血的方法进一步应用于对新生儿遗传性代谢病的群体筛查。虽然这项技术在制药工业中的应用还处于初期，GlaxoSmithKline (GSK, King of Prussia, PA)和其他公司在采用这种方法进行常规小分子定量方面已经取得了很大的进步，该技术在样品的采集和储存环节中体现出了道德和成本上的双重收益。这项技术有助于减少、改善和替代药物开发中动物的使用。目前所面临的挑战是采集充足样品的同时，还需要保证适当的全血采集体积且避免过多的使用动物。因为典型的血滴只需使用15μL血液，所以采用干血滴进行药代动力学和毒素动力学研究是比较合适的。如此小的采样体积只需要从一只啮齿动物体内连续取样而不需要从许多动物体内取样得到混合的血样，小儿科的试验也是如此。另一个考虑是运输和储存过程成本的节省，因为不管是需要干冰还是冷藏，运输体积都可以达到最小化并且可以远程进行临床实验。使用干血滴方法的典型分析过程包括如下步骤：将血滴到特种纸上(典型的是15~20 μL,但一些研究者使用100 μL)，然后将点样卡放到一个垂直的干燥架上，放置2 h或过夜，干燥后，将点样卡封入放有干燥剂的塑料拉链袋中，室温条件下运输到分析实验室中，再将卡片钻孔(典型的为3~4 mm)并排列成96孔板的形式，最后加入萃取剂并混合振荡30~60 min，除去上清液并注入液相色谱-质谱仪中进行分析。
虽然这项技术在采集和储存样本方面具有明显的优势，然而生物分析和检验分析要比标准的血浆分析复杂得多。通常需要优化的部分包括卡片类型的选择和萃取剂的选择。其他的优化部分需要依赖更低的定量检测限，包括点样和钻孔的尺寸。目前有4种类型的商品化卡片用于干血滴分析的开发和验证，其中两种卡片在使用添加剂进行化学处理后可用于细胞裂解(抗菌剂)和蛋白质变性，另两种卡片未经任何处理。虽然这些卡片添加剂在某些情况下增加了卡片的稳定性，但同时也增加了对质谱检测的抑制并需要充分的色谱分离，因而增加了方法的开发时间。
1 干血滴卡片样式
图1是目前使用的干血滴卡片的样式。卡片包含滤纸或类似的媒介，用硬纸板包裹以方便处理操作。为了方便鉴别，需要将它们标上色标，其标准尺寸如图2所示，此设计易于干燥、储存、运输和自动化。如图2所示，标准的卡片包含4个样品点和足够的空间用于置入条形码以便识别标签。为了能在运输和储存过程中更加充分地保护干血滴，目前正在设计一种塑料涂层的卡片，该塑料涂层设计的缺点在于增加了与封面相关的干燥时间及钻孔和卡片加工前额外的手工操作。
2 血样的点样和储存
在GSK临床前环境中，尾部刺伤是啮齿动物首选的采血模式，当然，还有其他的采血方式。使用微管收集血样，随后用带有刻度的EDTA涂层的毛细管点样。通过尾部刺伤也可用这些毛细管来采血，随后直接点样到干血滴介质上。从较大的动物体内采集血样，需先将血样装入微管中，然后用毛细管或移液管点样。GSK经验丰富的安全评价人员可以同时握住多根毛细管以加快采样进程。BASi公司(West Lafayette, IN)的自动化血样采集装置Culex对临床前物种血样采集的能力正在被考察。
在临床研究中，静脉采血、手指刺伤是首选的采样模式。同临床前的干血滴收集一样，血被收集到一个微管中或直接用毛细管点样。在生物分析实验室中，鉴于处理的血样体积较大及需点样的点样卡数量较多，连发移液管是在干血滴卡片上点样的首选工具。
由于点到干血滴介质的血样体积小，因此进行了大量的实验考察血滴体积偏差对分析准确度和精确度的影响。GSK所有的分析验证都要进行重现性实验，并以此得出可能存在的血滴体积的偏差。血滴的点样体积为10~20 μL, 并且需要进行点与点之间的相互对比。基于干血滴样中混合物分布的均一性及固定体积的钻孔，所有数值均被归一化并且精确度可控制在15%以内。
3 预处理和提取过程
一般情况下，工作溶液是在实验台上制备并由实验人员转入管内。Microlab STAR (Hamilton, Reno,NV) 或相似的机器人可进行一系列标样的稀释和全血的控制。机器人可以取0.8~5 mL样品于小管中，使用碳涂层的尖端进行凝块检测，此时适当的液体传感程序对于准确移液是非常关键的。卡片的选择依赖于多个因素并且需进行优化。
典型的萃取剂包含有机试剂/水的混合物，但必须进行优化以提高萃取效率。一般的钻孔尺寸为3~4mm，但有效的尺寸范围为0.35~8 mm (见图3)。钻孔尺寸大小的优化基于需要的检出限(例如，较大的孔可增加信号)和可用的血样的点样体积。手工钻孔是一个费力的重复性过程，会导致手和拇指疲劳，尤其是需要钻多个孔的时候。为了缓解这个问题，GSK-Research Triangle Park开发了一个标准的自动化手钻孔机(图3)，这个钻孔机包含了一个旋转的核心钻头，能从纸上切掉干血滴圆盘。它可减轻手部疲劳，因为钻圆盘时可用更少的外力，但钻一个孔仍需相同的时间。手工钻孔时间随分析人员而异，通常每钻96个样品孔需10~15 min。
GSK使用从BSD Robotics (Queensland, Australia)购买的BSD1000 GenePunch 机器人(图4)，最初虽然是为中、高通量实验室DNA分析而设计的，但应用到干滴采样中也很简便。正如上面提到的，在机器人装置中，卡片的设计模式在使用时是很重要的。先将带有边框的卡片预先装入一个卡片夹中，卡片夹可容纳300张卡片。卡片夹钳取出样品卡，然后扫描确定合适的钻孔面积。接下来，卡片被传输到钻孔模具中，冲孔成96孔板的形式。然后使样品回到卡片夹的初始位置。机器人完全由程序控制，条形码的阅读、点样感知和给定卡片的钻孔都非常方便。与手工钻孔相比，机器人系统每钻96个样品孔样品大约需要45 min。加入萃取液后的液体处理需要通过很多个Tom-Tec96-tip 机器人(Hamden, CT)完成。
4 检测和分析
GSK使用的整个平台包括从Applied Biosystems(Foster City, CA)购买的的API-4000 和API-5000。这些质谱系统使用的进样盘可容纳10个深孔板的UPLC系统(Waters Corp., Milford, MA)。很多UPLC系统有4个柱单元，可兼容不同分析方法，并可通宵运行多种方法。典型的运行时间为1.5 min，系统可以在18 h内运行近720个样品。
5 未来的发展方向
近几年来干血滴技术因其具有较大的优势得到了迅速发展。5年前，干血滴用于小分子分析的科学文献很少1,2]。现在，可以获得的科学文献很多，一些杂志甚至专门刊登干血滴技术的文章[9,10]，很多会议将干血滴技术纳入其研讨主题，干血滴技术的专题会议最近已在英国和美国召开，其他地方也正计划召开。这些会议讨论大多都集中在制定实施干血滴分析的统一化标准和验证需求上。会议的重要代表来自制药公司、合同研究组织、仪器制造商，他们聚集各自的优势资源于同一个主题——干血滴。在干血滴分析领域取得的改进包括增加自动化，在干血滴卡上喷射-沉淀内标物，稳定化处理和/或衍生化试剂均包含在内的特种纸，以及无需经样品预处理直接分析。
GSK 和 LEAP Technologies (Carrboro, NC) 的合作涉及到将内标物喷射沉淀到干血滴卡上。设计用于基质辅助激光解吸的LEAP TM 喷雾器，可将内标sitamaquine-d10喷到许多干血滴卡上。这项应用通常先进行前血和后血的点样，随后用钻孔技术提取，利用喷射-沉淀技术能得到可重现的、准确的结果。其他实验也计划用这种方法测试各种复合物。Wiseman等发表的一篇文章[11]详细描述了用解吸电喷雾离子化的方法处理干血滴的实验。在解吸电喷雾离子化中，离子通过大气压中的带电微液滴撞击样品的表面生成。喷雾的撞击形成表面微液滴层，微液滴是溶解分析物的浓缩相。随后其他的液滴与液层碰撞迫使溶解的分析物以微米级的液滴形式进入气相(大气)中，通过动量交换实现解吸[12]。该过程因消除了钻孔和从干血滴中除去外源性物质而更合理化。解吸电喷雾离子化的检出限比常规的钻孔技术高10倍，且这个过程能实现三维点样的无损采样和测得干血滴的确切含量。另一篇文章[13]描述了采用CAMAG (Muttenz, Swit-zerland) 的薄层色谱-质谱接口作为工具进行干血滴样品中药物的直接定量分析的应用。在该应用中使用质谱作为检测器，采用或不采用高效液相色谱分离均可。比起手工提取，采用薄层色谱-质谱接口直接提取具有显著优势，增加了所有检测物的响应信号。在应用中没有观察到背景噪声的相对增加，因此可以提高检测的灵敏度。这项技术更适用于在定量检测限较低情况下的干血滴分析。利用解吸电喷雾离子化直接分析技术的一个缺点是，在目前的条件下，缺乏分离代谢物、轭合物、内源性基质成分、卡片添加剂干扰物的色谱分析方法。未来的工作包括使用TriVersa NanoMate 纳升电喷雾系统 (Advion, Ithaca, NY)，它可以与亲水相互作用色谱填料填充的尖端 (HILIC-eTips, Advion)匹配，允许使用者在尖端部位安装一个干血滴钻孔器，从卡上顺序洗脱外源性物质，通过亲水相互作用色谱进入电喷雾离子化喷针。当与质谱自动化耦联时，这种配置能实现灵敏地、选择性地分析干血滴中的外源性物质，使用亲水相互作用色谱填料填充的尖端结合共流出峰的色谱分离，直接进行提取，显著地减少了工作量。这使结合色谱分离的直接分析成为可能。我们曾开展过一项调查研究，考察适合于生物基质中生物药品的定量的干血滴方法是否与传统血浆方法等效。利用干血滴技术，用来分析肽段exendin-4，质荷比为4186，含39个氨基酸。该干血滴方法得到成功验证。因此，目前我们建立了一个比当前猴子血浆方法更高灵敏度、更简单的方法，并且采样量仅为之前采样量的1/10;最终如果用近5μL干血，则干血滴的校正范围从10 ~2 000 ng/mL ;若用150 μL经固相萃取的血浆，则干血滴的校正范围从20~2 000 ng/mL。固相萃取被用于减少内源性基质的干扰以达到较低的定量检测限。比起血浆或全血，利用干血滴平台基质的稳定性更强。
6 结论
自动化和技术的进步将进一步促进实验室干血滴方法的广泛应用。尽管采用这种技术在改善、减少和替代药物开发中动物的使用三个方面具有明显优势，然而，干血滴方法的开发和分析仍然漫长而耗时。未来，干血滴的自动化和直接分析将加快这一进程。
参考文献：
[1] Beaudette P， Bateman K P. Discovery stagepharmacokinetics using dried blood spots. J Chromatogr B,2004, 809(1): 153 - 8.
[2] Mauriala T, Chauret N, Oballa R, NIcoll-Griffith D A,Bateman K P. A strategy for identification of drug metabolitesrom dried blood spots using triplequadrupole/linear ion traphybrid mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom,2005, 19(14): 1984 - 2.
[3] Barfield M, Spooner N, Lad R, Parry S, Fowles S. Application of dried blood spots combined with HPLC-MS/MS for thequantification of acetaminophen in toxicokinetic studies. JChromatogr B, 2008, 870(1): 32 - 7.
[4] Liang X, Li Y, Barfield M, Ji Q C. Study of dried blood spots technique for the determination of dextromethorphan and itsmetabolite dextrorphan in human whole blood by LC-MS/MS.J Chromatogr B, 2009, 877(8-9): 799 - 806.
[5] Spooner N, Lad R, Barfield M. Dried blood spots as a samplecollection technique for the determination of pharmacokineticsin clinical studies: considerations for the validation of aquantitative bioanalytical method. Anal Chem, 2009, 81(4):1557 - 63.
[6] Creton S, Billington R, Davies W, Dent M P, Hawksworth G M, Parry S, Travis K Z. Application of toxicokinetics to improvechemical risk assessment: implications for the use of animals.Regulatory Toxicol Pharmacol, 2009, 55(3): 291 - 9.
[7] Review. Edelbroek P M, Heijden J, Stolk L M L. Dried blood spotmethods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Therapeutic Drug Monitoring, 2009, 31(3): 327 - 36.
[8] Guthrie R, Susi A. A simple phenylalanine method for detecting PKU in large populations of newborn infants.Pediatrics, 1963, 32: 338 - 43.
[9] Ramakrishnan Y, Shabbir S, Miller S, Houlden J, Shadare J, Dewit O, Barfield M, Spooner N. A study to evaluatedried blood spot technology as a potential sample collectiontechnique following oral administration of paracetamol inhealthy human volunteers (2008). Bioanalysis, Aug 2010,in press.
[10] Kehler J, Bowen C, Evans C. Application of dried blood spots for the quantitative assessment of biopharmaceuticals.Bioanalysis, Aug 2010, in press.
[11] WisemanJM,EvansCA,BowenCL,KennedyJH.Direct analysis of dried blood spots utilizing desorption electrospray ionization (DESI) mass spectrometry. Analyst, 2010, 135: 720 - 5.
[12] Costa A B, Cooks R G. Simulation of atmospheric transport and droplet-thin film collisions in desorption electrospray ionization. Chem Communications, 2007, 38: 3915 - 7.
[13] Abu-Rabie P, Spooner N. Direct quantitative bioanalysis of drugs in dried blood spot samples using a thin-layerchromatography mass spectrometer interface. Anal Chem,2009, 81(10): 275 - 84.
作者简介
Mr. Bowen is Principal Scientist, GlaxoSmith-Kline, 709 Swedeland Rd., King of Prussia, PA 19406, U.S.A.; tel.: 610-270-4467; e-mail: chester.l.bowen@gsk.com. The author wishes to acknowledge Christopher Evans, Neil Spooner, and Jonathan Kehler from GSK Platform Technology and Science for their critical review and feedback.
