摘要 本文所描述的光学仪器，结合了液滴分光光度法的优点和平板读取器系统的高通量的能力。这项技术是基于一种多通道多色的平板读取器——DropSense96，并结合微流控DropPlate16/96耗材，用于1~3 μL样品的快速准确的紫外-可见光(UV-VIS)的光谱分析。它的特点是有较大的测量范围(没有样品稀释)并消除了样品的蒸发现象。DropSense96适合标准的微流控操作，可用于全自动化的工作流程。这个系统也很适合于在生物技术实验室中的核酸以及蛋白质样品的高通量定量分析和质量分析。
生命科学实验室正在逐步向自动化流体控制的方向发展，以达到成本降低、产率增加以及数据的一致性和质量改善的目的。因此，科学家们不需要大量繁琐沉闷的重复实验就能完成他们的研究，并且只是需要之前实验时间的一小部分。目前，集中于成本降低和实验速度提高的研究发展趋势，主要是将样品体积降低到微升的水平，典型的就是将样品放置于一个96-或者384-多孔反应板上，这在分子诊断学中已经有很好的范例。随着分子测试需求的增加，我们开发了一个利用12-到96-多孔反应板来进行生物分子分离的自动化方法。这种方法促使了全分子测试能够集成在一个自动化仪器上，它包括了仪器控制流体和条码化的样品追踪，得到了较高的样品处理通量;这个方法所需要的人力也更少，并且在处理小的脱氧核糖核酸(DNA)/核糖核酸(RNA)或是蛋白样品时，人为误差也得以消除。虽然生物分子的分离过程现在能够快速进行并且全自动化，但是在提取后样品质量和产量分析中仍出现一个下游的瓶颈。对于生物分子的定量，液滴分光光度法由于它的简易性、消耗样品体积少以及线性测量范围较宽而被广泛使用。然而尽管如此，分析仪器仍然需要手工操作，并且不能集成到流体控制装置上以用于大量样品的自动化处理。相比之下，紫外-可见光(UV-VIS)吸光度平板读取器适合于高通量的生物分子定量，然而这需要大量的样品来达到精确的测量，而且经常需要额外的稀释步骤来保证样品的操作处于线性范围之内。利用插入荧光染料和荧光平板读取器进行定量的方法，实现了最小化的样品消耗和测试的自动化，虽然在高通量分子实验室中该方法已被广泛接受和认可，但是它的成本很高，而且需要额外的操作步骤和标准样品(标准曲线)。
新一代的光学仪器和符合生物分子科学协会(Society for Biomolecular Science, SBS)标准的兼容微流控耗材，结合了液滴分光光度法的优势和平板读取器的高通量的特点，这种解决方案使得在一个高通量、自动化的工作流程中对少量样品进行直接的定量分析成为可能。
1 技术工艺
Trinean科技(Trinean ,Gentbrugge, Belgium)基于DropSense96多通道分光光度计与微流控DropPlate16/96相结合，用于对1~3 μL样品储存和进行UV-VIS光谱分析。PC机上的DropQuant软件可以实现简单的实验设计及测量结果输出。在微流控DropPlate耗材处理之后的样品吸光度能够被DropSense 96分光光度计所读取：DropPlate16拥有16个输入孔，可用于低到中通量模式;而有96孔、微量滴定板尺寸大小的DropPlate96可用于高通量模式。两者都能够和流体控制仪器(SBS标准)相匹配，并且允许简单的上样和样品的保留，以及在可变的通路长度下对液滴的吸光度进行测量。
典型的DropPlate微流控结构包括了一个可以连接到毛细管储存通道的输入孔，以及一个或者两个微比色皿，如图1所示。将样品液滴滴入到输入孔时，由于毛细管作用力，液滴会立刻进入储存通道，这样可以减少大量的样品蒸发。因此操作人员在样品滴入后，有2 h的时间充分地进行实验。将DropPlate插入DropSense 96后，样品会在压力驱动下传输到微比色皿，同时测量吸光度，以监测微比色皿的填充以及样品的吸光度。使用有两个微比色皿的DropPlate16/96D，可以进行双通路吸光度的测量(0.2和1.0 mm)，它能产生一个较大的吸光度(OD)范围(相当于0.1~70 OD，10 mm的吸光度)，因此就不需要对样品进行稀释了。DropPlate16/96S包含一个单比色皿，通路长度为0.5 mm，它适合于样品的高速分析，但是可用的检测浓度范围很有限(相当于0.2~24 OD，10 mm的吸光度)。DropSense 96包含了4个多色分光光度计，可以同时得到4个样品的全紫外-可见光光谱(不需要波长扫描)。整个DropPlate96的光谱分析在5 min之内完成。测量之后，DropQuant软件就会显示样品完整的UV-VIS吸收光谱图，并将数据储存于PC机上。在自动化实验室装置中，一个附加软件库可以对DropSense 96系统进行全积分，并且用户软件可以在数据库或者实验室信息管理系统(LIMS)中与常用的数据格式相匹配(比如xls, csv, txt和pdf)。总的来说，Trinean科技提供了快速和稳定的测量条件，得到了全紫外-可见光范围分析的结果;固定的通路长度和在DropPlate中所使用的平滑的光学表面;以及消除溶液蒸发现象，从而提高实验结果的重现性。
2 应用
基于耗材选择的多样性 (DropPlate或者标准的96孔孔板)、完整的UV-VIS光谱分析、标准曲线和动力学测量等方面的特性，Trinean科技的应用非常广泛。该项技术可用于DNA/RNA(A260)定量、蛋白质(A280)浓度分析、标记效率的测定以及比色实验结果。接下来描述的是DropSense96对双链DNA(dsDNA)(A260)、蛋白样品(A280)以及比色蛋白实验结果的线性和重现性方面的结果。利用DropSense96分光光度计，通过测量它在260 nm的吸光度，可以对核酸样品进行直接定量。此外，全波长吸光度光谱分析还能够帮助鉴定杂质，因为在260/230和260/280的吸光度比率是能计算出来的，而且背景的吸光度能够在320~750 nm的范围内检测到。在DropPlates16D中加入一组3 μL小牛胸腺dsDNA样品，这些样品的质量浓度在3和3 500 ng/μL之间，然后采用DropSense96和参考的液滴分光光度计对其进行测量，可以评价出DropSense96在动态范围内的测量精度。对每一个稀释溶液测量5次，并比较两个仪器所测的平均值，得到良好的线性关系，检测到的相关系数(R2)大约为1(图2)。
通过对一组小牛胸腺dsDNA稀释溶液连续测量10次来评估DropSense96的再现性。所有的测量都是在随机的DropPlates16D上充满一组3 μL样品，然后用同一个DropSense96进行测量。如图2所示，分别对15.5 ng/μL、21.2 ng/μL和1 039.7 ng/μL 3种质量浓度的dsDNA进行测量，计算出来的变异系数(CV)分别是2.9、0.6和2.2。测量纯化过的蛋白浓度，类同于核酸，利用Beer-Lambert公式中的吸光系数，采用DropSense96测量蛋白在280 nm处的紫外吸收并计算浓度。因为蛋白质在280 nm处的吸光度取决于芳香类氨基酸的存在，而蛋白质的吸收强度也取决于这种特定氨基酸的含量。为了论证DropSense96在蛋白质定量分析中的线性范围，制备一组质量浓度为0.2到60 mg/mL的IgG蛋白(来自牛血清，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的稀释溶液，采用参考的液滴分光光度计和DropSense96进行测量，后者是将3 μL样品放在Drop-Plates16D中。每个稀释溶液测量5次，然后计算平均值。通过两个仪器数据的比较结果得到了良好的线性关系，检测到R2为0.998 6(图3)。
不同的比色蛋白质方法已经发展为鉴定蛋白质的可用方法。其中最常用的方法是Bradford法、Lowry法、二喹啉甲酸(BCA)法和Pierce 660-nm法(ThermoFisher Scientific, Rockford, IL)。后者利用在酸性环境下蛋白质与染色物-金属混合物有一个特定的键合，它能引起染色物吸光度最大处的偏移的特点，可以在660 nm条件下测量到。通过绘制一个已知浓度的蛋白溶液的标准曲线，就可以计算出未知样品的蛋白质的浓度 (图4)。将样品放在DropPlates16D上利用DropSense96进行测量，从而测定了该660-nm法的动态范围。制备一组质量浓度为0.5~4 mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)(Invitrogen)的稀释溶液，取每个溶液10 μL与150 μL反应试剂在多孔板中混合。在室温下孵育5 min后，DropPlates16D上样3 μL样品，然后在DropSense96中进行测量。如图4所示，利用1∶5的蛋白质∶试剂，采用660-nm法可以得到的BSA质量浓度范围从0.05到2 mg/mL。
3 结论
Trinean科技结合了高通量的分光光度计和微流控DropPlate耗材，提供了高精确度和宽测量范围的可信的吸光度数据。由于可以进行UV-VIS光谱分析，这个系统提供了快速而稳定的测量条件;固定的通路长度;同时在DropPlate中使用光滑的光学表面，消除了过度的蒸发现象而使重现性得到提高。这个系统将一个微升样品读取器和高通量能力相结合，不仅能够使得样品消耗最小化，而且使样品在定量和质量分析中的时间缩短了近50%。在高通量实验室的核酸和蛋白质基础研究中，DropSense96可以作为一个强有力的工具。这项技术采用最小的样品消耗量实现了高速的分析，而这些样品消耗量是每个实验室都能承受的。
作者简介
Dr. Montoye is Application Developer, Trinean, Dulle Grietlaan 17/3 9050 Gentbrugge, Belgium; tel.: +32 92727535; fax:+32 92727539; e-mail:info@trinean.com.
