1 背景
分光光度计作为一种理化仪器,广泛应用于工厂、矿山、医院、科研单位以及高等院校的实验室,可在光谱区域360nm-800nm内对样品进行定性定量的分析。在医学高等院校的实验教学活动中分光光度计是必配的教学仪器,也是医学生必须熟练掌握的基本仪器之一。然而通过作者几年的实验教学,常常发现有很多学生对分光光度计的使用不很规范,更有甚者连基本的仪器调零都不熟悉,从而大大降低其实验结果的准确性和效率。为此,将学生在使用分光光度计中出现问题加以总结并提出其相应的解决方法。
2 问题、原因和解决方法
2. 1 透光率调节
2.1.1 调透光率时,弄不清楚是打开样品室盖,调透光率为0% ,还是关闭样品室盖,调透光率为100%。究其原因是对分光光度计的原理不清造成的。
俗话说“知彼知己,百战不殆”。只有清楚的对分光光度计基本结构的了解,才能为正确使用分光光度计打下良好的理论基础。以721型分光光度计光学系统结构为例,如图1所示。
由光源灯(1)发出的连续辐射光。射到聚光镜(2)上,会聚后,再经过反光镜(7),转角90,反射至入射狭缝(6),由此入射到单色器内,狭缝正好位于球面
准直镜(4)的焦面上,当入射光经过准直镜(4)反射后,就以一束平行光射向棱镜(3)(该棱镜的背面镀铝),就在其中色散,入射光在铝面上反射后是依原路反射出去,这样从棱镜色散后出来的光线,再经过准直镜(4)反射后,就会聚在出射狭缝上。出射狭缝和入射狭缝是共轭的。光经过出射狭缝后通过光楔(8)调整光量,通过聚光镜(9)进行聚焦,然后通过比色皿(10),由光门(11)控制光,再由光电管(12)接收,使光能转变成电能,通过微安表显示透光度、吸光度或浓度值。
当打开样品室盖,光电管暗盒前光门(11)自动关闭[1],从狭缝(6)射入比色槽(10)中光路被切断,由于没有任何光线通过比色槽(10)中待测样品参比溶液的比色皿,故透光率为0,即打开比样品室盖,调透光率为0。同理反之,关闭样品室盖,调透光率为100%。
2. 2 波长调整
2. 2. 1 忽视波长调整的重要性,更有甚者在做完实验后,才发现其波长未按实验要求所测物质最大吸收峰的特性来调整,结果徒劳无功。
其原因是学生对分光光度法原理一知半解造成的。分光光度法是比色法发展,原理是依据朗伯-比耳定律:
A=KLC
式中, A(或以ABS表示)为被测物质对单色光的吸光度值;K为被测物质的吸收系数;L为被测物质的厚度;C为被测物质的浓度。由上式可以得出,被测物质对单色光的吸光度与被测物质的浓度成正比。
朗伯-比耳定律发现了透光率的负对数值与物质的浓度成正比关系:
K值与入射单色光的波长及被测物质的特性有关,不同物质在不同波长的单色光下,有不同的吸光度值。故此,在用待测样本参比溶液调透光率之前,首先按待测样品溶液最大吸收峰的特性调整分光光度计的波长。否则,测量结果失去意义。
2. 3 比色皿规范使用
2. 3. 1 比色皿的使用不规范。比色皿的使用不当,不仅会大大降低实验结果的准确性,给实验结果带来较大的误差,而且会损伤比色皿,缩短其使用寿命。在使用比色皿这个环节中,学生出现的问题最多,最容易被忽视。主要存在以下三个问题:
(1)比色皿与比色皿之间不配套。
(2)用比色皿盛装所测试的样本溶液过程中,操作不规范。
(3)比色皿及比色托架在使用中放不到位,拉不到位。
其原因是做实验的态度不严谨,不认真,马虎所致。针对所出现问题的解决办法为:
(1)比色皿与比色皿之间要配套使用,成套同一厚度比色皿的厚度应相等,否则将使所测试样品的结果失去意义。故,在进行每次测试前均应进行校正。具体方法为:分别向被测的比色皿里注入同样的溶液,把仪器置于某一波长处,石英比色皿:220nm、700nm装蒸馏水,玻璃比色皿(只供340nm以上波长): 700nm处装蒸馏水,将某一比色皿的透光率比值调至100%,测量其它各比色皿的透射比值,记录其示值之差及通光方向,如透射比之差在±0. 5%的范围内则可以配套使用,若超出此范围应考虑其对测试结果的影响[2]。
(2)使用比色皿盛装待测样品时,建议按以下步骤进行操作:①校正和检查比色皿是否配套,是否完整,特别是比色皿透光面的光洁度。如果光面有细微的擦伤,会影响比色皿的透光率,给测量结果造成较大的误差。②清洗比色皿。如果比色皿着色较重,先用浓盐酸:甲醇:水的1: 4: 3的混合液30分种或用乙醇:乙醚的1: 1混合液浸泡30分种,再用蒸溜水仔细冲洗干净,倒置于滤纸或纱布上待干。切忌用硬试管刷涮洗比色皿。③用比色皿盛装待测样品时,先向比色皿倒入少量的待测样品进行润洗,再加入其待测样品至比色皿的3/4处。当待测样品浓度梯度较多而比色皿较少的情况下(一般一台分光光度计配四只比色皿),建议按浓度由低向高的原则,依次向比色皿加入待测样品。④用比色皿盛装完待测样品后,用擦镜纸或干净柔软的纱布将比色皿表面的水渍轻轻擦去或吸去,特别是比色皿光面的水渍。否则,影响比色皿的透光率。将盛装好样品的比色皿放入比色皿托架时,可以盛装好待测样品参比溶液的比色皿为起点,按盛装样品浓度由低向高的原则,依次将盛装好样品的比色皿安放在比色皿托架中。如图2所示。
(3)把比色皿放入比色皿托架中时,一定要把比色皿的光面放置光路的方向,保证比色皿彻底放入比色皿托架中;比色皿托架在放入比色池中应确保不倾斜,正确放置在比色皿托架底座的拉杆上。否则,就会使参比样品与待测样品的吸收光径长度不一致,还可能使入射光不能全部通过比色池,导致测试比准确性不符合要求;在测试样品过程时,比色皿架推拉到位,当拉杆到位时有定位感,到位时前后轻轻推动拉杆以确保定位准确。
2. 4 其它两个问题
(1)样品试剂、酸碱溶液等腐蚀性物品,尽量不要放置在仪器附近,取用时要十分小心,避免滴落或打翻在罩盖、样品室内部等处;如果有机溶剂滴落或打翻在罩盖、样品室内部等处,立即用柔软的布或纸将其擦试干净;如果酸、碱溶液打翻在样品室内部,立即将样品室拆开清洗、干燥。
(2)仪器工作环境应避免阳光直射,避免强电场、避免与较大功率的电器设备共电、避开腐蚀性气体,还应远离水池等湿度大的地方、干燥剂按仪器保养要求定期更换[3]。
3 总结
分光光度计是医学院校实验教学中经常使用的仪器,也是医学生必须熟练掌握的基本仪器之一。然而,很多学生对分光光度计操作不熟悉,甚至错误操作仪器,造成实验结果不准确且大大降低实验的效率。这与老师的教、学生的学和实验的次数是分不开的。老师应重在把分光光度计的原理讲透讲明,且在使用分光光度计容易出现问题的地方应重点指出。学生首先应端正做实验的态度,树立严谨、求实的作风。对出现的问题要勤动脑,仔细分析原因,尝试给予圆满的解决。不要一遇到问题就把责任推到是仪器方面。学生只有在实践过程才能遇到问题,有机会用所学的理论知识去解决问题,
从而掌握理论的精髓。学校要提供更多的实践(实验)机会给学生,学生应本着端正的实验态度,加上老师点津的实验指导,定能提高学生处理问题的能力。
参考文献
[1]邓光南. 721-100型可见分光光度计的故障诊断及排除[J].化学分析计量2006, l5(3): 51-52
[2]徐琳,李风雷.对分光光度计使用与维护问题的刍议[J].科技资讯2006, 11: 211
[3]崔巍. 721分光光度计光学系统的常规保养与调整[J].中华适宜诊疗技术杂志, 2004, 6(22): 25-26
作者简介:刘新(1979~),男,助理实验师,主要从事公共卫生学方面的实验教学。E-mai:l liuxin1515@ 126. com.
