摘 要:显微成像光谱仪技术是一种生物组织检测方法,目前广泛应用于生物医学检测和疑难病症分析,已成为组织检测领域的研究热点。论述了显微成像光谱仪各结构功能模块的工作原理及特点,并对其各主要技术指标进行了分析。介绍了目前的发展现状,并对所出现的多种显微成像光谱仪的技术方案及特点做了详细的总结。研究结果表明,显微成像光谱技术作为一种新的技术手段,必将在临床医学、生物学、材料学以及分析化学等领域得到广泛的应用。
1 引 言
近些年来,生物医学一直是国际上的热点研究领域,而生物技术的飞速发展也对新型先进显微观测技术的研究提出了越来越高的要求。自从荧光显微镜出现以后,尤其是在1957年自Marvin Minsky把共焦显微技术引入荧光观测领域以来,共焦荧光显微镜技术就以其独有的特点一直在生物组织研究中发挥着重要作用[1]。自20世纪80年代成像光谱仪技术出现以来,光学成像技术与光谱技术得到了有机地结合,它不仅能对物体进行形貌成像,而且还能提供丰富的光谱信息。由于它具有高光谱分辨率、多谱段、图谱合一等优点,所以在遥感领域获得了巨大的成功[2]。
最近几年,国际上开始出现了将荧光显微技术与成像光谱交叉的一种新的研究方向,即显微成像光谱技术。由于它在获得样品结构图像信息的同时可获得超高细分的光谱信息,也就是说可以得到样品信息的数据立方体,包括一维的光谱信息和两维的空间信息,所以为生物医学分析、矿物质研究和发光材料微结构分析提供了更加丰富的信息量,这在生物、医学、化学、材料学等领域具有极大的应用价值。由于显微成像光谱仪的独特优点,最近几年在国际上得到了广泛的研究。在国内,南开大学、天津大学、西安光机所、长春光机所和上海技术物理研究所等也都开展了这方面的研究工作[3—8]。
2 显微成像光谱仪的定义和功能模块
显微成像光谱仪技术是在普通的显微技术的基础上引入目前发展迅速的成像光谱理论而得到的一种新型的光学探测技术。它的工作原理如图1所示。主要包括光源、显微机构、光谱成像机构、扫描(推扫)机构和后续计算机处理五个模块。由光源发出的光,经滤光片、反射镜、显微物镜后照射在样品上。激发的荧光或样品表面的反射光再次通过显微物镜、反射镜、半透半反镜进入成像光谱仪,最后成像在成像光谱仪的像面CCD上,经计算机读出数据和光谱、图像重构程序进行处理,得到所需要的目标图像和光谱图。计算机操控样品台上下和左右移动,以实现样品的三维扫描成像。
主要功能模块及其特点:
(1)光源模块。光源模块是用来照明样品使其产生反射或激发样品使其产生荧光。照明方式可分为透射式和反射式两种。根据分析样品的不同需要选择不同的光源。在照明样品探测吸收光谱时,一般选用Hg灯等宽谱段光源。在激发样品探测荧光光谱时,要根据激发样品所需的光源波段的不同选择单色仪或激光器作为激发光源。
(2)显微模块。显微模块实现对样品的空间分辨,一般选择普通显微光学系统。近年来,为了提高探测荧光图像的空间分辨率,激光扫描共焦荧光显系统也得到了极大的应用。
(3)成像光谱模块。成像光谱模块主要实现仪器的光谱分光。目前采用的分光方式主要分为色散分光和干涉分光。色散型是一种传统的分光方式,技术上比较成熟,已经得到了大量的应用。但其能量利用率比较低。干涉型分光方式,尤其是傅里叶变换成像光谱仪,由于它具有高光谱分辨率、高能力利用率、多通道的特点,所以取得了飞速的进展,成为了成像光谱研究领域的新热点。
(4)扫描(推扫)模块。显微成像光谱仪结构是通过计算机操控样品台进行移动的。利用样品台的平动实现对样品的推帚成像;利用样品台的上下移动,实现对样品的断层扫描成像。为了获得准确的光谱图像,必须对样品台的扫描(推扫)机构的运动速度进行精确的设计、控制。一般通过计算机控制步进电机来驱动样品台的精确运动。
(5)后续计算机处理模块。后续处理模块包括数据采集、数据定标、数据重构三个系统。数据采集系统指的是对CCD探测器数据的读出、采集、传输、控制、存储和实时显示等。数据定标指的是通过测定成像光谱仪对一个已知辐射特性目标的响应,得到仪器的仪器函数,从而可根据成像光谱仪所获取的数据准确得到所观察目标的超光谱图像信息。数据重构系统是指对数据进行变换等处理,实现对数据的三维重构,获得可视化的样品内部结构图像信息和光谱分布信息。
3 主要技术指标
显微成像光谱仪技术是成像光谱技术与显微技术结合的产物,因此它的一些技术指标是相互制约和相互综合的结果。显微成像光谱仪系统的主要指标的确定需要考虑系统的综合性能和两分系统相互制约等因素。
(1)光谱范围。光谱范围主要根据处理的样品特性和分光方式而定,一般根据反射光吸收光谱的范围或所激发的荧光光谱的范围来确定系统的工作光谱范围。
(2)谱段数。谱段数的选取主要根据CCD面阵相机的光谱像元数的多少而定,没有严格的标准。但对采用傅里叶变换干涉仪的分光系统来说,为了能实现快速傅里叶变换(FFT)和提高数据处理速度,一般选择谱段数为2的整数次幂。
(3)空间分辨率。空间分辨率主要由显微物镜的数值孔径、放大倍率和CCD像元大小而定。在采用激光扫描共焦荧光显微系统中,空间分辨率可比普通显微系统的空间分辨率提高大约1.4倍。
(4)光谱分辨率。光谱分辨率主要与分光系统的设计有关。在色散型分光系统中,光谱分辨率与分光计的狭缝宽度有关。狭缝越窄,光谱分辨率越高,但系统的光能利用率随之降低,因此一般在保证足够光通量的前提下,减小狭缝宽度,以提高光谱分辨率。在干涉型分光系统中,光谱分辨率与狭缝宽度无关,只与系统的最大光程差有关。
4 显微成像光谱仪设计原理及工作特点
随着显微成像光谱仪技术的飞速发展,世界各国的科学家们研制了很多种采用不同技术手段的显微成像光谱仪方案。这些不同的技术手段主要集中在光谱分光方式上。根据成像光谱中分光机理特点的不同可以把它们分为两类:一类是色散分光型,它包括光栅型、棱镜型和滤光片分光型;另一类是干涉分光型,主要包括基于Michelson干涉仪的动镜型和基于变形Sagnac干涉仪的空间调制型。
4.1 基于光栅-棱镜-光栅组合分光的显微成像光谱技术
图2所示为上海技术物理研究所的研究人员设计和研制的一种显微高光谱成像仪的原理图,它是基于光栅-棱镜-光栅分光方式的[9]。整个系统的光谱范围为400~800nm,谱段数为120个,光谱分辨率小于5nm,空间分辨率可达到1.125μm。
处于显微镜载物台上的样品被柯勒照明系统照明,瞬时视场内的样品条带通过显微镜物镜成像在分光计的狭缝处,然后再经过光谱分光组件后,在垂直于样品条带方向按光谱色散,最后成像在CCD像面上。CCD光敏面平行于狭缝的一维称为空间维,垂直于狭缝的一维称为光谱维,在空间维每一行光敏元上得到的是样品条带的一个光谱波段的像,面阵CCD相机每帧图像便对应于一个样品条带的多光谱图像。通过载物台自动装置对样品进行推扫,就可得到整个样品的二维图像和光谱数据,即数据立方体。
棱镜、光栅分光是一种传统的、技术发展比较成熟的分光方式,基于棱镜或光栅分光的光谱仪器主要缺点是系统信噪比受通光孔、狭缝的限制,通光孔、狭缝越窄,光谱分辨率越高,但系统接收到的能量也随之降低。
4.2 基于线性可变滤光片的显微光谱技术
图3为一种基于线性可变滤光片分光的显微成像光谱仪的结构原理图。它由显微镜、线性可变干涉滤光片、微动平台、CCD摄像头、图像采集卡和计算机六大部分组成[10]。其原理是,由光源发出的光经反射镜和聚光镜照明载物台上的样品,样品的物光经过显微物镜、半透半反镜、45°棱镜和目镜可供人眼观察,或通过成像物镜和线性可变干涉滤光片成像在CCD摄像头的感光面上,CCD摄像头的输出连接图像采集卡,图像采集卡连接计算机。线性可调滤光片是一种新型的分光方式,这种仪器的结构设计比较简单。目前存在的主要问题是透光效率低、光谱范围有限、光谱分辨率较低,另外波长调谐时存在像移。
4.3 基于动镜型干涉仪的显微成像光谱技术
图4是基于Michelson动镜型干涉仪的显微成像光谱仪的结构原理图。由样品点出射的光,经过显微物镜和半透半反镜进入Michelson干涉仪。由于动镜的循环往复运动,所以可在CCD探测器光敏面上得到随时间变化的干涉图,通过对干涉图的傅里叶变换就可以复原出光谱信息。
在该系统中,由于系统的光谱分辨率由系统的最大光程差决定,所以具有很高的光谱分辨率。另外,由于它不含狭缝,光能利用率高。其缺点是:由于动镜只有循环运动一个周期后才能得到一个完整的干涉图对其进行变换处理,所以不适于快速变化的光谱测量;动镜要求匀速运动,对倾斜、晃动等参数要求很严格,所以该系统不适合应用于现场实地检测。
4.4 基于Sagnac干涉仪的显微成像光谱技术
图5是基于Sagnac干涉仪的显微成像光谱仪的结构原理图。在该系统中, Sagnac干涉仪通过分束器横向剪切每一束光线,得到两束互相平行且具有一定光程差的光线;在CCD光敏面上将两束光线收集在一个点上,根据相干特性产生干涉图;通过推扫载物台,对每一行样品进行分析;最后再通过傅里叶变换复原出光谱信息。在该装置中,由于没有运动部件,因此具有良好的稳定性和可靠性,适合于野外现场工作;虽然它与色散型分光方式一样,都依靠一个狭缝来实现推扫方向的空间分辨,但其光谱分辨率与狭缝宽度无关,因此可以在空间分辨率允许的情况下,加宽狭缝,从而增大视场角、提高能量利用率。该结构的缺点是,由于其光谱分辨率由最大光程差决定,而最大光程差由设计时横向剪切仪的剪切量决定,因此限制了该方案的光谱分辨率。
4.5 基于线阵针孔推扫的激光扫描共焦显微成像光谱仪LP-LCSMIS技术
如图6所示,系统分为共焦显微光学子系统和空间调制型成像光谱光学子系统。线阵检测针孔阵列既位于共焦显微子系统中的线阵光源针孔阵列的共焦位置,又位于成像光谱子系统中的傅里叶透镜的前焦面,所以它既是显微系统的像面,又是成像光谱系统的物面。在线阵检测针孔位置所成的样品点的像被分束器在傅里叶透镜的前焦面横向剪切为两个虚像,它们经过傅里叶透镜,最后被柱面镜在CCD探测器上收集,并发生干涉,得到干涉图。最后通过对干涉图的变换,复原出样品点的光谱信息.
在该显微成像光谱仪技术方案中,由系统得到的干涉图的强度分布为
在该方案中,线阵检测针孔阵列是其关键部件。线阵检测针孔阵列的离焦不仅会影响装置的光谱分辨率和空间分辨率,而且会极大地降低仪器的性能,对由装置获取到的生物组织的光谱信息和图像信息的正确性产生影响。因此必须设计良好的调整和装配工具,尽可能的减少系统的离焦量,以期获得理想的干涉图分布。
LP-LCSMIS装置相对于以前研究的显微成像光谱仪来说具有三个主要优点:较高的光谱分辨率;由于采用了扫描共焦显微光学系统,相对于基于普通显微系统的显微成像光谱系统来说,具有较高的空间分辨率和轴向深度解析力,能重构出组织内部的三维图像,实现立体成像;由于采用了空间调制成像光谱技术,相对于基于棱镜、光栅和滤光片等分光元件的色散型显微成像光谱技术来说,能够提供更大的光通量,适合于弱光探测,这在生物医学研究领域显得更为重要。
5 应 用
虽然显微成像光谱仪技术的研究工作是最近几年才开始兴起的,目前尚处于探索性研究阶段,但它在很多领域已显示出潜在的应用前景。生命科学是显微成像光谱技术最具有影响力的应用领域。它可以广泛应用于染色体识别、癌症诊断、皮肤病检查、细胞功能研究、蛋白质相互作用研究等许多方面。另外它还可以与多荧光探针标记分析技术相融合,得到试样更加丰富的信息。显微成像光谱技术在材料领域也有着广阔的应用前景,特别是对发光材料的分析,例如Si基纳米材料的研究[11]。在石油化工领域,它可以用于分析含油岩心表面的荧光光谱信息和空间信息,研究岩心中的石油运移,判断原生油层[12]。
6 结 论
显微成像光谱仪技术的出现在显微领域实现了图像分析和光谱分析技术的有机结合,不仅具有空间分辨能力,而且还具有光谱分辨能力。由于显微成像光谱技术所具有的独特优点,使其研究取得了巨大的进展,出现了各种各样的技术手段和方案。分析了显微成像光谱技术的各功能模块及主要特点,总结了其主要技术指标,并对目前出现的各种有代表性的技术方案及其特点做了分析。可以看出,显微成像光谱技术作为一种新的技术手段,它必将会在临床医学、生物学、材料学以及分析化学等领域得到广泛的应用。
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作者简介:苏星(1974-),男,陕西省人,中国科学院西安光学精密机械研究所博士研究生,主要从事显微成像光谱技术及微型化的研究。
E-mail:suxing-2000@sina.com
