摘 要 表面等离子谐振(Surface Plasmon Resonance, SPR)生化分析仪是一种基于物理光学原理的新型生化分析系统,SPR技术作为一种表面反应的生物传感技术,具有很重要的生化分析能力,可用于无标记实时监测许多种类生物分子之间的反应。SPR生化分析技术已成为直接实时观测生物分子间相互作用的主导技术。近年来SPR传感技术受到重点研究和发展;SPR生化分析仪也已经商品化。在本文中详细介绍了自行研制的新型SPR-2000型生化分析仪,仪器的主要性能是:入射角扫描范围40°~70°,测角精度优于1×10-3度,探测折射率范围1.04~1.47,温度范围4℃~60℃、检测灵敏度可达10-11M等等。利用该系统实时测试了1gG-GAH IgG的动态反应过程。
实验证明该分析仪精度和灵敏度高,适用范围宽,并已提供多家使用,具有比较好的商品化性能。
1 引 言
21世纪是生命科学的时代,在分子水平上认识和研究生命现象是当今研究的热点。近年来一种先进的生物化学分析方法和技术———表面等离子体谐振(Surface Plasmon Resonance, SPR)测试技术得到广泛的重视和迅速的发展。
SPR技术是基于物理光学特性的一种分析技术,利用光学SPR技术测定时,将一种反应物(如配体)固定在传感芯片表面金属膜上,含分析物的样品(受体)以恒定的速度通过传感芯片,与传感芯片上分子间的相互作用,引起表面膜的光学参数变化(如折射率变化等),将带来SPR光学信号的改变。记录和处理这些信号可将整个反应过程显示出来。分析时不需预先处理和纯化。整个测量可在数分种内完成,而传统技术需数小时、甚至数日的分析。
传统的分析方法局限于体外实验或使用离体器官进行。必须进行标记,才能对有关实验系统进行示踪,跟随实验过程,研究有关动力学过程。传统的表面分析技术,例如X射线光电子能谱(XPS)、俄歇电子能谱(AES)以及次级离子质谱(SIMS)等,不仅费用比较昂贵,设备庞大,灵敏度有限,而且都不能研究有关动力学过程。与传统技术相比,SPR技术的优点极为明显,不需要进行标记,表面生物分子间的相互作用可以直接、实时、原位地进行监测,样品需要量少,可以监测吸附或解吸附过程的连续反应,可以监测可逆性程度,也可以详尽地研究生物分子相互作用的动力学过程。SPR分析技术的出现,大大加快和优化免疫测定过程;更为DNA和蛋白质之间的研究带来了重大突破。几十年来,DNA和蛋白质之间相互作用,特别是其反应动力学的测定一直没有简便快捷的方法,而SPR技术解决了这一难题。
SPR分析技术在美、英、日等国都在进行大量研究应用[1,2,8],每年都发表大量论文,有人统计仅1999年就有507篇[9];SPR生化分析仪性能也在不断改进。作为商品Phamacia公司的Biacore系列产品占据国际市场主导地位,并已进入中国市场。由于价格昂贵,售出不多,仅有数台。目前已出现多种结构、不同调制方式的SPR生化分析仪。我们设计研制谐振角调制型SPR生化分析系统已有十多年历史[3~7],先后研制成立式SPR分析系统和卧式SPR分析系统。本文介绍SPR-2000型卧式系统,其具有很高的精度,测角精度达1×10-3度,入射角变化范围很宽,从40°到70°,可测定气体和液体样品,具有通用性。试用证明是一种有特色、实用、可靠的SPR生化分析系统。
2 原 理
表面等离子体谐振是由入射光的电磁波和金属导体表面的自由电子形成的电荷密度波相互作用产生的。这种沿着金属导体(金,银)表面传播的电荷密度波是一种电磁波,被称为表面等离子体波(SurfacePlasmon Wave,SPW)。它是一种消逝波,在金属内部的分布是随着与表面垂直距离的增大而指数衰减。根据Maxwell方程,可以推导出该电磁波的波矢ksp[1]:
如果入射光波矢k在x方向上的投影kx等于SPW波波矢ksp时,入射光波就会在金属表面引起SPW波的共振,入射光波的大部分能量被SPW波吸收,转化成为热量,因此反射光强最弱,这种现象被称为表面等离子体谐振(SPR)。通常采用的是ATR(Attenuated Total Reflect)方式的Kretschmann结构来实现SPR要求。在金属的上表面放置一个高折射率的棱镜,调整合适的入射角θ和入射光波长λ,就由可能使得,即:
这就是产生SPR现象的条件。我们研制的SPR-2000型生化分析系统,是采用调整入射角度来实现SPR的。
3 系统结构
3·1 系统组成
SPR-2000型生化分析系统由以下几个主要模块组成:
机械扫描系统、光学系统(入射光源、光接收器、光路系统)、流体注入分析系统、生化传感器芯片、系统控制和分析软件等五个主要部分组成。
3·2 机械扫描系统
采用机械扫描的原因是不仅可改变入射角,而且
可以满足被测物适用面广的要求。本系统设计了新颖的菱形连杆扫描结构,仅使用一个电机即可完成扫描功能,简化了结构降低了成本。这种结构已申请了专利[7]。扫描入射角范围是40°~70°,测角精度达1×10-3度,测量折射率范围是1.04~1.47,可适用于气体和液体样品测量,是一种应用面宽的实用系统。
3·3 光学系统
光源采用波长为650nm的纵模半导体激光器。具有体积小、稳定性好等优点,但是它的输出光是有像散和不对称的高斯发散光束。为了满足SPR应用要求,使用了透镜来对光路进行校正。校正后输出光再使用一个起偏器来获得线偏振光输出。为了使输出光频率与光强稳定,本系统采用了高精度的电流源。
光接收采用光电二级管来测定光强变化。
3·4 流体注入分析系统
流体注入系统主要由蠕动泵、进样阀、流通池、控制模块及与主机接口的电路等四部分构成。它具有进样和清洗两种工作状态:清洗时,由蠕动泵推动载液流过流通池,对管路和流通池进行清洗;进样时,将蠕动泵和进样阀反转,先把样品吸入管路,然后,蠕动泵和进样阀正转,将样品推入流通池进行反应。该流通系统由微机控制,可以任意调节流速和流向,最大流速为7600μl/min;最小流速为4μl/min。
3·5 生化传感芯片
生化传感芯片由载体和生化敏感膜构成。载体是由玻璃片上镀50nm厚金膜并粘附在胶木片架上构成。使用时在裸金膜上固定上生化敏感膜即可使用。固定化方法有多种,可以按使用者要求实施。
3·6 系统控制和分析软件
本系统设计的目标是尽量使系统产品化,测量过程自动化。因此,精心设计系统硬件,使系统检测性能达到高精度;我们还使用Delphi 5.0,设计了操作简便、功能完整的系统控制和分析软件。软件的主界面
如图4所示:
本软件主要包括系统控制、数据处理和文档管理等功能。操作界面符合Windows标准,简单易学。系统控制采用Wizard向导技术,使用户对系统的日常操作从同一入口进入,省去了学习各菜单项的麻烦,可以快速开始工作;文档管理采用Ms Access数据库进行管理,提供强大的查询、统计功能;另外还提供了多种数据处理方法供用户根据实验数据的实际情况进行选择。
4 系统分析结果及性能
4·1 SPR曲线
图中,X轴表示扫描步数,可以自动转换为对应的角度,Y轴表示每步对应的光强。从图中可以看出,SPR吸收峰与二次曲线很相似。为了获得精确的SPR吸收峰角度,采用4阶的多项式来对峰谷两边的数据点进行最小二乘法拟合。最小二乘法是离散曲线数据点的常用方法,用在这里取得满意的结果。利用SPR-2000型生化分析系统,可以对气体、液体多种样品进行检测,获得满意的SPR曲线。
4·2 机械扫描精度实验
本仪器采用机械扫描的方法实现角度扫描,以此来获得大的折射率测量范围。这就要求机械扫描的高精度和好的重复性。为此,必须进行机械扫描精度的实验。对菱形臂来回扫描结果表明,SPR曲线的峰值的最大值和最小值之差为10个步长,而且绝大多数的点都位于平均值附近,根据设计,每步长对应的角度位移是10-4度,所以机械扫描的精度达到3×10-3度。
4·3 折射率测量精度
根据SPR产生条件式(3),可以推导出被测物折射率与SPR谐振角之间的关系:
计算表明,当θ精度达到1×10-3时,检测的折射率精度可达到10-5,由前面给出的机械扫描精度可知,本系统可检测的折射率精度达到10-5量级。
4·4 生化反应动力学过程测定
实验材料:
PBS缓冲液:0·12N NaOH+1% Triton X-100;IgG (500μg/ml)从鼎国生物材料公司获得:
GAHIgG (按1:250稀释)从华美工程公司获得。采用SPR-2000型生化分析系统实时监测IgG-GAH IgG(羊抗人IgG)的免疫反应。实验采用原位反应的方法,即利用流通注射系统将样品依次推动到反应池内,同时实时监测反应的变化。如图6所示。图中,X轴是时间;Y轴是谐振角的度数。
图中A段表示,在通入PBS溶液3分钟后达到稳定,通入0·12N NaOH和1% Triton X-100 4分钟,对金膜表面进行清洗。这样可以看到吸收峰呈现出指数下降的趋势,并逐渐趋近于稳定;随后通入PBS溶液冲洗3分钟,直至趋于稳定。完成对金膜的预处理。
图中B段表示,通入500μg/ml IgG溶液,对IgG分子在金膜表面的吸附进行实时监测,可以看到曲线呈现指数上升的趋势,在20分钟后,趋于稳定。通入PBS 6分钟,可以看到曲线并无明显下降,说明IgG分子已经结合到金膜表面。从图中可以看出,整个升的幅度是0·161度。
图中C段表示,通入GAH IgG抗体溶液,对反应进行实时监测,曲线呈现指数上升的趋势,在1小时后,趋于稳定。通入PBS溶液清洗10分钟,可以看到曲线并无明显下降,说明IgG分子与GAG IgG分子已经结合。从图中可以看出,曲线表示整个动态反应过程,上升的幅度是0.350度。
5 结 论
SPR生物、化学分析技术是近十年来在国际上兴起的一种新型生化分析仪,技术水平发展很快,应用范围越来越广泛。SPR技术可用于检测蛋白质、核酸、多糖、磷酯、小分子如药物;能监测分子间的相互作用情形,如蛋白质-蛋白质、药物-蛋白质、核酸-蛋白质、核酸-核酸、受体-配体等分子之间相互作用的情形等等。监测某一特定受体的结合部位、活性位点的数目以及结构上的改变对这些部位的影响,检测分子间有无结合、结合的强度、速度、解离的快慢、结合位点分析、是否有空间效应等。这种方法灵敏度极高,一般都达10-10M,分析速度很快,可在数分钟内完成。目前尚无其它技术,能在同一系统中提供这么多这么快的信息。
本文对自行研制的SPR-2000型生化分析系统进行了详细介绍,对其性能进行了测定和分析。利用该系统对IgG-GAHIgG免疫系统反应进行了实时检测。结果表明,本系统具有很高的机械扫描精度,生物反应的灵敏度高,可达10-11M并配有流通注射系统和完善的计算机控制和分析软件,适用于生物分子相互作用的实时检测。流通注射系统和计算机控制软件的配合,使进样和清洗等工作自动化了,用户只需按照系统提示,放置相应的样品,即可完成实验的测量。SPR-2000型生化分析系统已提供给多家研究单位应用。实验和应用表明这是一台实用化、智能化、现代化分析仪器,能为生物化学分析研究做出贡献。
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本文作者：崔大付 李向明 蔡浩原 李亚亭 郑自攀 陈 翔
