摘 要 介绍了安培、线性扫描、方波、吸附溶出伏安法、库仑法、电导和电势法、电化学发光、电化学传感等电化学方法在微全分析系统(μ-TAS)中的应用,并指出了电化学检测微全分析系统的发展方向。
1 前 言
1989年Manz[1]等提出了微型全化学分析系统(μ-TAS)的概念,它的特点是:分析速度快、信息量高、操作费用低、试样消耗小、污染少,此外μ-TAS将所有化学分析所需要的器件集成到一起,更有利于现场分析,可显著降低分析过程中可能出现的误差,为人们提供直接的分析数据和信息[2]。
μ-TAS是以分析化学为基础,微加工技术为依托的跨多种学科的领域,是当今分析仪器发展的前沿,对未来分析科学的发展将起很大的推动作用,因此发展μ-TAS是我国科学界面临的一个紧迫课题。
μ-TAS概念促使不同研究领域的研究人员以新的方式从事其研究工作[3],微型化检测器、微型化反应器,以及毛细管电泳芯片等微型分离器件在μ-TAS中的应用越来越广泛。伴随微加工技术的发展,适用于μ-TAS的微型化检测系统也得到相应的进展,目前主要使用激光诱导荧光光谱(LIF)检测,质谱(MS)检测器的研制也受到一定关注[4,5],但是这些检测方式尚需进一步缩小检测装置体积,降低成本,以便与芯片实验室匹配。相比而言,电化学检测是μ-TAS中很好的检测方式。电化学检测灵敏度高、选择性易于调变、试样用量少、成本低,特别是电化学检测装置特有的微型化的特点,与微加工技术很匹配[6]。近几年电化学检测在μ-TAS中的应用逐渐增多,安培法是应用较多的电化学方法,此外还有线性扫描、方波、吸附溶出伏安法、库仑法、电导和电势法、电化学发光(ECL)、电化学传感器等。
2 电化学检测在μ-TAS中的应用
2·1 安培法
安培检测一般采用光刻、化学镀、金属真空喷镀等方法制作纳米级的薄膜电极,或者采用印制方法制作厚度约10微米的厚膜电极作为工作电极,电极宽度一般介于10至300微米之间。安培检测已用于DNA片段、神经递质、人体代谢产物、氨基酸、糖、炸药、环境污染物的分析。
Ewing[7,8]等设计了一种CE进样、矩形毛细管道电泳分离、安培检测的连续分离分析装置。阵列电极对沿分离管道宽度方向分布的流出物选择性响应,并可以与样品在取样毛细管中的位置相对应,称为定位检测器,可给出三维分析信息,具有良好的时间精度和化学灵敏度,适用于连续变化的生物微环境的分析。
Matheis[9]等首次将电化学检测方式集成到CE芯片中(图1)。通过光刻技术在玻璃基底上制作Pt工作电极和对极。多巴胺、肾上腺素、儿茶酚的分离效率分别达21000/m、17000/m、12000/m理论塔板数,检测限分别达3·7uM、6·5uM、12uM。采用间接电化学方法检测了ΦχHaeⅢ受限消解产物和沙门氏菌PCR扩增产物。该分离分析系统具有较高检测灵敏度和分离效率,使芯片实验室概念成为现实。
Luong[10]等以甲醛作为还原剂通过无电沉积方式在CE芯片毛细管出口的玻璃基底上镀一层Au膜,厚度约为100nm,制成的Au工作电极循环伏安行为与商品化Au电极很相似,检测性能良好。这种电极制作方式简单,不需要复杂的仪器设备,一般的实验室用湿化学方法都可以进行。Lunte[11]等首次在CE芯片上设计了双电极检测器。在玻璃基底上用光刻技术制作4个微带电极,电极间距40um。硅橡胶层中制作出分离和进样管道,硅橡胶层和玻璃基底可逆地密封在一起。该检测系统比传统CEEC体系中双电极的设计和制作简单。
Wang等在安培检测应用于μ-TAS方面进行了非常系统的研究。他们[12]提出了一种相对简单的电极制作方式,使用金属喷镀仪在芯片毛细管出口处喷镀一层厚度约为200nm的Au膜,导电连接后作为工作电极使用。以多巴胺和异丙基肾上腺素为被测物,检测限分别为1·0uM,1·3uM。
他们[6]还首次将厚膜电极应用到CE芯片安培检测中。使用半自动印刷机,在100×100×0·64mm的铝陶瓷板上制作印制电极,最后制作好的印制电极条上的工作电极有效面积为0·3×2·5mm,厚度10um,称为厚膜电极。电极稳定性较高,检测性能理想。此外厚膜电极电镀修饰一层Pd超微细颗粒,用于检测肼类化合物[13]。
除设计了一系列适用于CE芯片的检测器之外,他们[14]在CE芯片上设计了各种化学反应系统,例如可在4min内同时分离检测葡萄糖、尿酸、抗坏血酸和乙酰氨基苯的CE芯片分析系统(图2)。该设计的独特之处在于葡萄糖被催化氧化成葡萄糖酸和H2O2的反应沿毛细管分离管道同时进行,酶解成的过氧化物同尿酸、抗坏血酸分离(图3)。厚膜电极在含Au(Ⅲ)的电解液中电镀一层Au膜,作为工作电极。这种酶分析和电泳分离集成在芯片上的方式,对于代谢产物快速分析,以及高速临床微分析多重管道芯片的开发具有很高的实用价值。
之后不久他们[15]在CE芯片上将氨基酸电化学衍生反应、电泳分离、安培检测集成在一起,氨基酸柱前衍生成电化学活性物质,分离后进行柱端安培检测,可同时分离检测8种氨基酸,检测限达2·5uM。Rossier[16,17]等设计了一种一次性的以碳电极为工作电极和参比电极的PET(聚乙烯对苯二甲酸酯)CE芯片。用激光在100um厚的PET板上刻出管道,充入碳墨水,70℃固化之后,加工成碳微带电极。研究了不同电极构型检测池的性能以及分离管道构型对管道内传质的影响。
Fang[18]等设计了一个流动注射(FI)进样,芯片毛细管分离,安培检测的FI-CE联用系统,FI可以连续进样,提高了CE高速分离的性能。使用直径150um的铜微盘电极检测了蔗糖和葡萄糖,检测限分别为2uM,1uM,线性工作范围为10~1000uM。
2·2 线性扫描、方波、吸附溶出伏安检测除安培检测外,Wang[19]等将线性扫描、方波、吸附溶出伏安等电化学方法应用于带有反应系统的芯片进行检测,以儿茶酚、肼、TNT、NI为被测物表征了几种伏安检测方法。方波伏安检测得到TNT的检测限为2×10-12M,溶出伏安方法检测Ni-DMG配合物反应体系中的Ni。
2·3 库仑检测
电化学库仑检测器是近年来发展起来的一种新型电化学检测器,其主要特点是动力学测定范围宽、灵敏、可进行阵列检测、电极稳定、维护方便、并且可对同一流出峰进行纯度分析等,是流动体系的一种新型检测器。电极一般采用多孔材料,目前已发展研制阵列库仑检测器(图4),增加检测器的解析能力和信息量,提高灵敏度和稳定性,并使其微型化,与微型分离系统配套。
2·4 电导和电势检测
有关电导和电势检测在微分析系统应用的报道很少。Prest[20]等设计了一种聚合物等速CE芯片(图5),聚合物芯片加工过程中直接将电极安装于两块聚合物板中间,分离管道的尺寸是深56um,宽324um。实验证明这种检测器精确度高,制作简单。
电势检测也是μ-TAS中有应用价值的一种检测方式[21]。一系列微型液膜离子选择性电极(ISE)、涂层液膜线状ISE、导电聚合物涂层ISE以及陶瓷和金属等材料制作的ISE已成功地用于LC和CE等流动体系的检测。目前的研究倾向于发展固态ISE,因为固态ISE更加耐用,容易微型化制作并与分析系统集成。随着微型化和集成技术的提高,涂层膜技术以及ISE相关理论的发展,ISE将更多地应用于μ-TAS中。
2·5 ECL检测
电化学发光检测具有灵敏和选择性好,容易进行时间和空间调变的优点,此外电极可制作成金属薄膜、或直接在基底上制作金属涂层,与微型光检测器结合在一起可制作成微型电化学发光探针。电化学发光主要用于免疫和DNA杂交分析,还广泛用于流动体系检测有机胺、蛋白质、药物以及生化样品。Hsueh[22]用硅制作了Ru(bpy)2+3ECL检测池(图6),用于分析DNA PCR扩增产物。检测池用微加工的硅片或者玻璃片制作,低温固化的聚酰亚胺粘合在一起,ITO薄膜电极热粘合在玻璃板上,硅检测池体上用光学刻蚀方法制作Au薄膜电极,分别作为阳极和阴极。这种微型化的检测池容易和PMT或SPD等光检测器组合在一起。
Kremesk tter[23]设计了一种体积只有5·4ul的ECL流通检测池,光学玻璃上涂一层ITO层作为工作电极,共价结合葡萄糖氧化酶。利用luminol与过氧化物的发光反应检测葡萄糖含量,PMT作为光检测器。
Fiaccabrino[24]等在面积5×6mm2的硅芯片上制作了微型的ECL探针,包括电极、光检测器等器件(图7)。芯片上的两个检测池内安装Au叉指阵列微电极(IAD),电极位于pn型光二极管检测器的上部,电极上产生的光可被检测器直接检测,微分方式记录光强度信号。这种芯片ECL探针设计简单,将检测和ECL反应集成一体,对于μ-TAS而言是一种很好的微型化器件。
从微型化制作技术角度来看,以上微型ECL检测器可以加工在CE芯片上,与进样、反应、分离部分集成在一起,组成一个μ-TAS。
2·6 电化学传感器
目前微制作技术在EC传感器中的应用很普遍,有关的研究报告也很多[25],EC传感器的体积更小,样品用量更少,分析性能提高,集成技术发展也很快一些分析系统从采样、进样、分析、数据显示已集成到便携装置上。不同的EC传感器集成在一起,用于医学、环境科学、生命科学分析中进行多重检测分析。
Murakami[26]等在18×44mm2的硅片上制作了葡萄糖氧化酶(GOD)固定柱和电化学流通检测系统,GOD共价结合在管壁上。玻璃芯片上加工EC流通检测池,用真空蒸镀的方法制作Au薄膜电极,作为检测池的工作电极和对极。该工作是较早将流体通道、反应和检测集成化的研究报道之一,对μ-TAS研究是个很好的尝试。
Uban等设计了几种集成的电化学传感器。他们用薄膜工艺在玻璃板上制作了总面积为1mm2的Pt阵列工作电极,修饰不同的酶可同时检测葡萄糖和乳酸[27]以及L-谷氨酰胺和L-谷氨酸盐[28]。后来他们又制作成性能稳定、高通量的传感器阵列,与微型流通池组合在一起,用于活体多种代谢产物的分析[29]。
Cooper[30]等设计了一种电化学传感器,检测池宽100~160um,深20~25um,所需样品体积只有190pl,Au电极采用电子束蒸镀方法制作,这种传感器可以用于单细胞代谢分析。池体所采用的聚合物是一种透明材料,因此也可与光学检测系统集成在一起。
Tierney[31]等设计了一种与皮肤接触采样分析人体葡萄糖含量的安培型传感器,包括Pt电极工作电极,微型检测池和离子电渗方法采样器。这种传感器系统通过微型和集成化,已经制作成类似手表大小的、可以随身携带的“葡萄糖表(GlucoWatch)”,包括2个传感器恒电位器,离子电渗恒电流器,电子控制部分采用ASIC芯片制作,并与微处理器和存储芯片集成,LCD显示器等,一块AAA型电池做电源,可以进行采样、样品处理、数据处理和存储、数据显示,并自动运行下一次检测。
此外,许多传感器已经实现微型化,并已经商品化,用于现场采样分析,显示数据。微型电化学传感器与微流芯片技术结合在一起,将进一步扩大μ-TAS应用范围。
3 结论与展望
μ-TAS的研究已经成为国际分析化学领域研究的热点,μ-TAS技术在应用性和产业化方面极具潜力。随着微加工技术向纳米尺度发展,μ-TAS也将更加集成和微型化,功能更加完善。由于电化学检测固有的灵敏度高、选择性好、试样用量少、微型化、低成本等特点,将成为μ-TAS中广为应用的检测方式。电化学检测发展的方向,一方面是进一步微型化,使检测系统与μ-TAS更加匹配,另一方面是设计更多的化学和生物物质的电化学标记物以及芯片上柱前、柱后电化学衍生反应器,以扩大电化学检测的分析范围,还要发展功能更加完善的电化学检测方法,可对同一体系进行多重分析。
参考文献
[1] Manz A, Graber N, Widmer HM. Sens. Actuators, 1990, B1:244
[2] Kutter J P. Trends in Anal. Chem., 2000, 19:352
[3] Verpoorte S. Trends in Anal. Chem., 2000, 19:350
[4] Zhang B, Liu H, Karger B L, Forer F. Anal. Chem., 1999, 71:3258
[5] Oleschuk R D, Harrison D J. Trends in Anal. Chem., 2000, 19:379
[6] Wang J. Tian B, Sahlin E. Anal. Chem., 1999, 71:5436
[7] Gavin P F, Ewing A G. J. Am. Chem. Soc., 1996, 118:8932
[8] Gavin P F, Ewing A G. Anal. Chem., 1997, 69:3838
[9] Woolley A T, Lao K, Glazer A N, Mathies R A. Anal. Chem.,1998, 70:684
[10] Hilmi A K, Luong H T. Anal. Chem., 2000, 72:4677
[11] Martin R S, Gawron A J, Lunte S M. Anal. Chem., 2000, 72:3196
[12] Wang J, Tian B, Sahlin E. Anal. Chem., 1999, 71:3901
[13] Wang J, Chatrathi M P, Tain B, Polsky R. Electroanalysis,2000, 12:691
[14] Wang J, Chatrathi M P, Tain B, Polsky R. Anal. Chem., 2000,72:2514
[15] Wang J, Chatrathi M P, Tian B. Anal. Chem., 2000, 72:5774
[16] Rossier J S, Schwarz A, Reymond F, Ferrigno R, Bianchi F, Gi-rault HH. Electrophoresis, 1999, 20:727
[17] Rossier J S, Roberts M A, Ferrigno R, Girault H H. Anal.Chem., 1999, 71:4294
[18] Fu C G, Fang Z L. Anal. Chim. Acta, 2000, 422:71
[19] Wang J, Polsky R, Tian B, Chatrathi M P. Anal. Chem., 2000,72:5285
[20] Prest J E, Baldock S J, Bektas N, Fielden P R, Treves Brown BJ.J. Chromatogr. A, 1999, 836:59
[21] Nagels L J, Poels I. Trends in Anal. Chem., 2000, 19:410
[22] Hsueh Y-T, Smith R L, Northrup M A. Sens. Actuators, 1996,B33:110
[23] Kremesk tter J, Wilson R, Schiffrin D-J, Luff B J, Wilkinson JS. Meas. Sci. Technol., 1995, 6:1325
[24] Fiaccabrino G C, de Rooij N F, Koudelka-Hep M. Anal. Chim.Acta, 1998, 359:263
[25] Suzuki H. Electreoanalysis, 2000, 12:703
[26] Murakami Y, Takeuchi T, Yokoyama K, Tamiya E, Karube I,Suda M. Anal Chem., 1993, 65:2731
[27] Urban G, Jobst G, Aschauser E, Tilado O, Svasek P, VarahramM, Ritter Ch, Riegebauer J. Sens. Actuators, 1994, B18-19:592
[28] Moser I, Jobst G, Aschauser E, Svasek P, Varahram M, UrbanG. Biosens. Bioelectro., 1995, 10:527
[29] Jobst G, Moser I, Svasek P, Varahram M, Trajanoski Z, WachP, Kotanko P, Skrabal F, Urban G. Sens. Actuators,1997,B43:121
[30] Cai X, Gildle A, Cooper J M. Electroanalysis, 2000, 12:631
[31] Tierney M J, Kim H L, Burns M D, Tamada A, Potts R O.Electroanalysis, 2000, 12:666
本文作者：刘继锋 曹卫东 汪尔康
