摘 要 激光扫描共聚焦显微术是先进的分子和细胞生物学研究技术。它在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置,结合数据化图像处理技术,采集组织和细胞内荧光标记图像,在亚细胞水平观察钙等离子水平的变化,并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系。由于它的应用范围较广泛,已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学和药理学等研究领域中很重要的研究技术。
1 激光扫描共聚焦显微镜的基本原理和发展
科学研究工作对更高图像分辨率的追求产生了激光扫描共聚焦显微镜。随着免疫荧光技术在生物学研究领域的广泛应用,研究人员注意到,荧光显微照片的分辨率较低,传统的荧光显微镜使用场光源,因标本邻近结构(细胞或亚细胞结构)产生的衍射光和散射光的干扰,使标本中细微结构的成像不够清晰。激光共聚焦显微镜的主要原理是利用激光扫描束通过光栅针孔形成点光源,在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描,采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管(PMT),再经过信号处理,在计算机监视屏上形成图像。由于激光光源的光栅针孔和探测针孔对物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于光栅针孔和探测针孔,进行点扫描时,扫描点以外的点不会成像,经逐点扫描后才形成整个标本的光学切片(Optic section)图像(见图1)。
早期的激光扫描共聚焦显微镜采用的是扫描速度较快的狭缝扫描方式,由于其在平行狭缝的光轴面上无共聚焦原理,图像分辨率不高,而被淘汰。随后发展起来的是阶梯式扫描技术,它克服轴外像差,平行移动工作台来逐点扫描标本,提高了图像分辨率,但是对标本制备要求太高,也难于成为成熟的技术。现在的激光扫描共聚焦显微镜采用的是驱动式光束扫描器,具有扫描速度较快和符合共聚焦原理的特点。目前激光扫描共聚焦显微镜的光源设计和分光采集技术也有较大的改进。首先是激光器的快速发展,使得现代的激光扫描共聚焦显微镜可以根据研究需要选择不同的激光器,如Ar UV (351,364nm),HeCd(442nm),Ar(457,488,514nm),ArKr(488,568,647nm),Kr(568nm),HeNe(543nm),HeNe(633nm)等。选择激光光源时,一方面要满足研究工作对波长的需求,另一个方面要考虑到激光光源的寿命。其次是近年来对于激光束分光和荧光采集原理也有较大的突破,目前大部分激光扫描共聚焦显微镜仍采用选择性波长滤片轮进行分光和荧光采集(见图2),这样的装置完全与传统的荧光显微镜一样使用激发波长
滤片和吸收波长滤片来完成对不同的荧光标记进行选择性的成像。最新一代激光扫描共聚焦显微镜可以用棱镜狭缝分光的新技术,配上合适的激光源后,能够摆脱传统的波长滤片组的限制,连续和自由地选择最佳波长(见图3),这一特点对于现在和未来开发出的各种新的荧光标记物(特别是各种荧光蛋白和荧光染料)和研究动植物的自发荧光物质有很高的价值,从某种意义上,这一技术革新已使新一代激光扫描共聚焦显微镜超脱了传统的荧光显微镜系统。与此同时用于激光扫描共聚焦显微镜的物镜也做了较大的改进,不但具有平场复消色差特性,而且能与高速扫描功能相匹配
2 激光扫描共聚焦显微镜的主要生物学应用
2·1 组织和细胞中荧光标记的分子和结构的检测标本制备方法主要有免疫荧光组织和细胞化学法、荧光蛋白标记分子法、荧光细胞染料标记法等。与传统的荧光显微镜相比,除了有较高的分辨率以外,一个主要的不同是激光扫描共聚焦显微镜可以利用激光点扫描成像,形成所谓的“光学切片”,进而可以利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像,因此可以用于观察切片和一些表面不平的标本,特别是研究具有长突起的神经元时更有使用价值。同时可以做三维图像重建和标记强度的半定量分析。
2·2 定量或半定量测量Ca2+和pH等细胞内离子浓度及变化利用Fluo-3、Fura 2等荧光探针可以测量Ca2+在活细胞内的浓度及变化。一般来说,电生理记录装置加摄像技术检测细胞内离子量变化的速度相对较快,但其图像本身的价值较低,而激光扫描共聚焦显微镜可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像,这对于研究钙等离子细胞内动力学有意义。最好与电生理等技术相结合来观察离子变化与电生理学指标的相关性。
2·3 荧光光漂白及恢复技术
利用高能量激光束将细胞内某一部分中选定靶区域的某种荧光淬灭,然后观察邻近相同的荧光标记物重新扩散入该区域的速度和方式,从而分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。一般来说,需要用荧光蛋白等标记物标记需要研究的分子,进行细胞转染表达后再做以上的实验。
2·4 长时程观察细胞迁移和生长
目前激光扫描共聚焦显微镜的软件一般均可自动控制地进行定时和定方式的激光扫描,而且由于新一代激光扫描共聚焦显微镜的探测效率的提高,只需要很小的激光能量就可以达到较好的图像质量,从而减小了每次扫描时激光束对细胞的损伤,因此,可以用于数小时的长时程定时扫描,记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。
2·5 其他的生物学应用
用高能量激光束进行细胞损伤和损毁实验,一般要用紫外激光束进行细胞损毁;细胞间通讯研究;光解笼锁活化技术等。
3 结束语
激光扫描共聚焦显微镜是目前生物学领域应用最广泛和图像分辨率最高的实验仪器,随着其技术本身的不断进步,使激光扫描共聚焦显微镜变得更灵敏、小型化和实用。总体上来说,激光显微图像技术有两大发展趋势,其一是激光扫描共聚焦显微技术,从光学物理工作原理上进一步革新,显著提高其检测效率,从而进一步减小荧光淬灭和细胞光毒性,使之成为能够进行长时程记录(大于8小时)的高分辨率显微成像仪器;另一方面是与多光子技术相结合,提高激光束的组织穿透能力和减少细胞光毒性。目前,多光子显微技术仍处于初级发展阶段,主要优点是细胞光毒性较小,可用于更长时程的记录,同时组织穿透性较好,理论上的最大穿透深度可达200~500μm,主要问题是其分辨率比激光扫描共聚焦显微镜低,仪器常需要进行光合轴,另外价格十分昂贵。因此,在未来的几年内,高质量的激光扫描共聚焦显微镜仍然是生物医学研究中最有效和最有使用价值的主要研究仪器之一。
参考文献
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本文作者：张 旭 徐维奇
