摘 要 利用紫外可见分光光度计、荧光光度计及原子力显微镜测定罗丹明B与双链DNA的相互作用方式,探讨罗丹明B对DNA的识别模式和作用机制,希望能够为特殊的药物分子对DNA的特异性识别提供有益信息。
1 引 言
DNA分子的识别模式研究是当今国际科学前沿领域的一个研究热点,尤其在抗癌、抗艾滋病新药的设计和研制上具有重大的意义和广阔的前景。近年来,国内外许多科学家都在研究DNA分子的识别模式,以期能找到识别DNA分子的新型化合物,已经取得了一定成就。通过将小分子化合物与DNA相互作用,发现它们之间的作用模式有以下三种:插入模式、沟槽模式、静电作用模式,但化合物的功能基团、结构特征及其作用所引起的相应核酸分子结构变化的关系及作用机制还存在许多亟待研究的问题。因此,进一步设计和研究对DNA分子有显著识别作用的新型化合物,不仅在理论上,而且在应用上都具有十分重要的意义。鉴于此,本文通过吸收光谱、荧光光谱、原子力显微镜(AFM)等仪器分析方法,着重研究荧光探针罗丹明B识别DNA的作用机制,并采用AFM初步探讨了其相互作用的纳米形貌和结构特征
2 实验部分
2·1 仪器与试剂
2·2 实验方法
2·2·1 紫外可见吸收光谱研究
在此吸收滴定实验中,我们保持罗丹明B在混合溶液中的最终浓度不变,为5×10-6mol/L,而改变DNA的浓度,用UV-2001测出不同DNA浓度对罗丹明B的吸收光谱图。
2·2·2 荧光光谱研究
在荧光光谱滴定实验中,我们使DNA的浓度始终保持为4×10-4mol/L,同时改变罗丹明B浓度,进行滴定实验,然后使溶液在261nm时被激发,检测罗丹明B在572·6nm处的荧光强度。另外测定没有DNA参与的相应浓度的罗丹明B的荧光强度,并进行比较。
2·2·3 AFM样品制备及表征
将新鲜解离的云母片上滴一层10-2mol/L的氯化镁(MgCl2)溶液静置一分钟,让其充分吸附Mg2+后,用二次蒸馏水冲洗,再将此云母片上滴上样品溶液,于37℃的恒温箱中快速烘干,用AFM观察云母表面样品分子的纳米形貌。本实验将浓度为10-5mol/L的罗丹明B溶液与浓度为5ng/mL的DNA分别作用15min,60min和120min,用AFM进行表征,并与纯DNA样品的AFM纳米形貌进行比较。
3 结果与讨论
3·1 吸收光谱
在紫外可见吸收光谱滴定实验中,保持罗丹明B在混合溶液中的最终浓度一定,为5×10-6mol/L,而改变DNA的浓度,在每次增加DNA后,记录罗丹明B峰位置和峰强度值。图1为DNA参与前后罗丹明B的吸收光谱。表1为不同DNA浓度下罗丹明B吸收光谱的变化情况。
以上吸收光谱研究表明,随着混合溶液中DNA浓度的逐渐升高,罗丹明B的吸收峰的强度逐渐降低。当DNA的浓度由0增加到1·0×10-4mol/L时,罗丹明B的吸收峰由0·593降低到0·534,但罗丹明B的吸收峰峰位置没有发生任何移动,一直为533·8nm。根据现象推测,罗丹明B可能进入到了DNA的沟槽中,它是以沟槽作用方式与DNA相互作用,且作用较强烈。
3·2 荧光光谱
在荧光光谱滴定实验中,我们发现罗丹明B这种探针与DNA结合可强烈地使荧光探针发生淬灭。因此,在与DNA相互作用后,罗丹明B的荧光强度急剧下降,但是与吸收光谱相类似的是,罗丹明B的荧光峰位置始终没有发生移动。荧光光谱的研究再次证明了我们的推论,即罗丹明B是以沟槽方式与DNA相互作用的。
表2为荧光光谱滴定实验结果,其中I0和I分别表示DNA参与前后不同浓度的罗丹明B在572·6nm处的荧光强度。
由表2可见,当溶液中罗丹明B的浓度为5×10-7mol/L时,DNA的浓度为该浓度的800倍,这时,罗丹明B的荧光强度降低了80·50%;当溶液中罗丹明B的浓度为1×10-5mol/L,DNA浓度只是它的40倍时,罗丹明B的荧光强度就已下降了80·18%。这说明,随着罗丹明B在溶液中比例的增大,它与DNA碰撞作用的几率也相应增加,更多的罗丹明B分子进入了DNA的大小沟槽,进入沟槽的分子在水溶液中的荧光猝灭现象非常明显,此处反映为荧光强度下降得更为迅速。
3·3 AFM的表征
图2是浓度为10-5mol/L的罗丹明B与DNA相互作用的AFM形貌图。图2(a)中,DNA的链宽大约为90nm,高度3nm;图2(b)中,可以看见DNA的链凝聚缠绕在一起,其高度有7nm左右;图2(c)中,出现块状凝聚体,大小约在160~180nm,这些图片直观地展现了化合物与DNA相互作用过程中的纳米结构特征。从实验中可以看出,罗丹明B与DNA作用发生在某些特定位点上,随着其摩尔浓度比或反应时间的变化,其纳米形貌也相应发生较大程度的变化。在反应时间较长或罗丹明B与DNA摩尔浓度比较高的情况下,DNA链将会出现缠绕或打结,最终形成块状凝聚体。
4 结论
本实验通过对罗丹明B与DNA相互作用的紫外吸收光谱、荧光光谱的研究,并通过AFM表征,初步得出以下结论:罗丹明B是以沟槽模式与DNA相互作用的,且作用较强,当然,要进一步揭示其相互作用的具体位点,还需进一步利用振动光谱等手段进行详尽的探讨和研究。
参考文献
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本文作者：王雪梅 龚声瑾 李 尧 江贤
