摘 要 系统地介绍了目前国内外集成毛细管电泳芯片(微流控芯片)高灵敏检测技术的发展概况,重点讨论了激光诱导荧光、化学发光、电化学检测和质谱等检测技术在微流控芯片中的应用,以及芯片检测技术所面临的微型化、集成化、高通量以及接口设计等关键问题。
在过去的几十年里,微型化、集成化和自动化技术的推进使得微电子技术得到革命性的发展,并极大地带动了许多产业的进程。然而在生命科学的世纪———21世纪到来之际,纵观生物化学、制药、临床诊断等相关领域,目前大多数实验室的试验过程都是相当低效、繁重和费时的,而这对于研究过程极为复杂相关因素极多的生命现象的工作来说,是不能满足要求的。在这种情况下,近十年以来生物芯片(或称芯片上试验室)成为高科技领域最为重要的一个研究热点。有人提出,就象集成电路芯片对于计算机和电子产业曾经起到的作用一样,生物芯片将给生物、化学、医药、环境等等相关领域带来革命性的变化和发展[1,2]。可以说,生物芯片是近十年以来生物、化学、微型加工和微电子技术、信息采集和处理技术等多门科学技术综合发展和交叉的产物,是生物科学和分析化学一个革命性的里程碑。
生物芯片大致可以分为两种,一种是基于杂交或亲和作用的微型阵列芯片[3~6];另一种则是在固体材质上制造出的微流体生化分析芯片(或称毛细管电芯片)[7,8]。通过对微型管道网络系统中流体的控制、处理和检测,可以对极小量的生化样品和试剂进行样品处理(如过滤、附近、稀释、混合和反应)、分离及检测,再加上并行处理的设计,从而实现对于复杂样品快速、低耗、高效、高通量、大信息流量的分析。由于芯片极大地降低了样品和试剂的使用量,以及器件尺度的减小,这样发展与之相匹配的检测技术就成为芯片技术发展的关键问题之一。因此,下面将主要对近年来国内外微流体芯片在检测器系统方面的研究和应用作一介绍:
1 激光诱导荧光检测
前面指出,芯片的一个重要的特点是极大地降低了样品和试剂的使用量,如目前最低的进样量已可低至1pL,由于流体和器件尺度的减小,对于检测技术灵敏度的要求就被提到了一个重要的位置,这样,激光诱导荧光检测技术就以其高灵敏度成为目前大多数微流体芯片采用的检测方式[9]。不同的研究小组在光路的设计、光学元件的配置等问题上因其研究对象、理念和技术力量等实际情况的差异而有所不同。目前,采用的光学系统根据主要设计原理大致可以分为透射式和落射式共焦系统两类,而后者因其能够更有效地利用激发光源、降低噪音和便于调节,已成为优先选用的设计。除了在光路上的硬件设计以外,为提高在微小管道中痕量样品的检测灵敏度,信号处理也是研究者关注的一个热点。同时采用CCD(电荷耦合器件)对相关区域的流体行为进行观测的分析也广泛地被采用。
高处理量的要求是芯片发展的一个重大趋势,这不仅对芯片本身的设计和制作提出了更高的要求,也对检测器和数据处理能力提出了新的挑战,如Math-ies的小组1999年在直径为10cm的圆形基片上制作了96根管道的微流体芯片[10],特殊设计的激光诱导荧光共焦检测系统能够同时检测所有管道中样品的分离。目前,与Caliper Technologies合作由AgilentTechnologies推出的全球第一台微流体芯片系统LabChip Systems:Agilent 2100 Bioanalyzer中所使用的芯片就是可同时对12个样品进行分析的多通道芯片,平台中采用激光诱导荧光技术对凝胶筛分的DNA或RNA片段进行检测。
激光诱导荧光检测器的微型化也在MEMS技术的支持下迅速发展,虽然到现在为止,在大多数微流体芯片研究的实验室中,仍然是传统光电器件架构的检测系统占主要地位,但不可否认,随着半导体光电器件在芯片上集成的进一步发展,性能优越的微型化、集成化的光学检测单元将会成为主流。目前如光源、光纤、滤光部件、反射部件和光敏二极管都已实现了在微流体芯片上的集成。
2 质谱检测
由于使用激光诱导荧光检测常常需要进行荧光衍射,因此质谱正在成为微流体芯片研究中最受关注的检测器之一。通过为质谱提供良好的样品前处理及分离途径,并通过进行的设计极大地提高处理通量,微流体芯片与MS的联用已经表现出了极大的应用前景和良好的技术可行性。
微流体芯片与质谱连用的关键首先在于接口的制作,Karger[11]和J.M.Ramsey[12]的小组都采用从芯片末端流出的液滴直接在静电的作用下喷雾进入离子源这种方式;Figeys[13]和Harrison[14~16]等使用毛细管将芯片和质谱连接起来。各种方式都各有其优缺点。
在质谱与微流体芯片的连用中,常常有研究者仅将芯片作为一个进样装置,但质谱虽然可以同时对几种成分进行分析,检测复杂的样品时如果没有预分离就往往会造成信号下降或是背景化学噪音,而如果能够利用芯片进行分离或预处理则可降低干扰,改善峰形。Harrison等就利用芯片的分离能力,得到了Pisum sativum中一种外源凝集素的胰蛋白酶消解产物的电泳分离谱图和质谱谱图,理论塔板数达到了300,000。
如何提高微流体芯片与质谱的接口性能,降低加工成本仍是目前有待研究解决的问题,一个更有潜力的设计思想是利用现有的微细加工技术将电喷雾的喷嘴直接制作在芯片上,这将为蛋白分析提供一个强健易用的装置,其中又以塑料作为此微型结构材料的设计最具应用潜力。
上面已经提到,蛋白组和药物筛选工作面临的将是巨大数量的分析对象,因此高处理通量的chip/MS系统也一直为人们关注,如Karger的小组在1997年第一次将有六条并行管道的芯片与质谱连用起来,对肌红蛋白的分子量进行了测定[11]。Aebersold则采用了分时策略令多条管道公用一个喷雾出口的设计[13]。尽管目前将质谱的微型化具有某些应用能力,但它对质谱分析的灵敏度和选择性的提高并不能起到多大作用,而芯片上各种样品前处理结构的集成将确实会给实验室工作的自动化和成本的降低带来福音,将微流体芯片作为质谱的样品前处理和进样装置已成为几个重要小组的明确研究理念。
3 化学发光检测
化学发光检测具有成本低、灵敏度高、线性范围宽、一般反应和检测装置相对比较简单等特点,近年来它的应用发展很快,覆盖的范围也很广泛。但常规毛细管电泳与化学发光检测器的接口较为复杂,同时容易引入死体积和湍流现象造成分离效率下降,而微流体芯片上能利用微细加工技术制作零死体积的柱后反应器从而避免这些问题,因此微流体芯片利用化学发光达到高灵敏度和高选择性的检测是具有潜力的。Mangru和Harrison[17]在微流体芯片上制作了柱后反应器,用辣根过氧化物酶(HRP)过氧化物酶鲁米诺三元体系对其特性进行了探索,并进行了免疫分析,表现了化学发光在生物大分子尤其是蛋白分析中应用的潜力。
4 电化学检测
电化学检测一向以其灵敏度高而著称,同时,加上超微电极的广泛使用,使得微流体芯片与电化学检测器连用后,可望得到一个灵敏且真正集成化和微型化的分析装置。如Mathies的小组在电泳芯片上集成了三电极体系的电化学检测[18]。由于微电子加工技术在电极、电路、和微细结构制作上的优势,通过对微流体电化学检测芯片系统的集成化和微型化,最有希望得到一个体积小,甚至是便携的装置。
5 结 论
微流体芯片系统仍有许多问题有待解决,架构一个真正的“芯片上实验室无疑还需要众多领域的科学工作者和工业界协同的努力。而检测系统及其接口的研制、微型化、在高处理通量中的使用无疑是此领域最为重要的一部分,如何提高其灵敏度和处理通量将是我们都需要面临和需要投入大量工作的重点。
参考文献
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本文作者：金亚 温涛 王义明 罗国安
