摘 要:显微成像光谱仪技术是最近新兴的一种生物组织检测方法,它可以广泛应用在生物医学检测,疑难病症分析、预防、诊断中,已经成为当今生物组织检测领域研究的热点。提出了一种新型的基于线阵针孔阵列的激光扫描共焦显微成像光谱仪系统LP_LSCMIS方案,介绍了其工作原理及优点,讨论了该装置中线阵针孔阵列离焦对系统性能的影响,分析了离焦对生物组织荧光图像的光谱分辨和自体荧光光谱的调制深度的影响。推导出了光谱分辨和调制深度与离焦量的关系式。结果表明,离焦对仪器的性能有较大的影响,因此在装置装调时要求有更高精度的调整机构。
0 引 言
在生物医学研究领域,生物组织的自体荧光检测已经被广泛地应用于疑难病症的预防和诊断研究[1]。19世纪80年代,激光扫描共焦荧光显微镜的出现以后,它就一直在生物组织荧光研究中发挥着重要作用[2]。然而,荧光显微镜只能够提供生物样品中组织的荧光图像信息,为了获得足够多的信息辅助疾病诊断,科学家开始寻求更加有效的研究手段。与此同时,成像光谱仪技术在遥感领域获得了巨大的成功[3]。最近几年,国际上开始出现将荧光显微技术与成像光谱技术交叉的一种新的研究方向,即显微成像光谱技术。由于它可以在获得生物组织结构图像信息的同时,获得其超高细分的光谱信息,即可以得到样品信息的数据立方体,包括一个维度的光谱信息和两个维度的空间信息,这就为疾病研究诊断,诸如胃、肝、肾等的组织自体荧光检测,提供了更多的辅助信息。由于显微成像光谱仪在疾病诊断中的优点,最近几年它已经成为生物医学检测研究领域的热点,在国际上得到了广泛开展,在国内南开大学、天津大学、西安光机所、上海技术物理所等都开展了相关方向的研究工作[4—8]。
本文介绍了一种我们自主提出并正在研究的基于线阵针孔阵列,并采用共焦显微光学技术与空间调制成像光谱技术的激光扫描共焦显微成像光谱技术LP_LSCMIS,介绍了其工作原理,讨论了它相对于其他显微成像光谱装置的主要优点,从理论上分析了其关键部件,线阵针孔阵列的离焦对生物组织荧光检测的影响。目前国内外均未见有同种结构系统研究的相关报道,具有一定的创新性。
1 LP_LSCMIS的工作原理
图1是我们正在研究的基于线阵针孔阵列的共焦显微成像光谱仪LP_LSCMIS的结构原理图。如图所示,它可以包括两个子系统,显微光学子系统和成像光谱子系统。首先,由光源发出的光入射线阵光源针孔阵列,并由每个针孔出射,照到半透半反镜的下表面,经反射后下行透过显微物镜照射到样品表面,并激发样品产生荧光。同样地,样品荧光又以相反的方向沿相同光路到达半透半反镜的下表面并由下表面透射,上行照射到线阵检测针孔阵列上。由于线阵光源针孔阵列与线阵检测针孔阵列处于共焦位置,根据共焦理论,每个被线阵光源针孔照明并激发荧光的样品点元都能成像在与其一一对应的线阵检测针孔阵列的各个针孔上,因此由每个样品点元发出的荧光均能顺利透射过检测针孔,进入成像光谱子系统。在我们的装置设计中,线阵检测针孔阵列的位置位于傅里叶透镜前焦面上,它既是共焦显微光学子系统的像面,又是成像光谱子系统的物面。由针孔出射的每束光线被Sagnac分束器横向剪切为两束互相平行的光线,它们经过傅里叶透镜,最后被柱面镜收集到傅里叶透镜的后焦面,并由后焦面上的面阵CCD探测器来接收。由于两束光属于相干光,能在CCD上得到它们的干涉图样。对所获得的干涉图进行傅里叶变换,可以获取到每个样品点的超光谱信息。
通过对所获取的干涉图数据的处理、重构,可以得到样品内部生物组织结构的图像和光谱信息。在该装置中,样品台由步进电机驱动,沿水平和垂直方向运动,对样品实现逐层扫描成像。通过这种方式,可以最终得到样品的三维图像信息及一维光谱信息,即所说的四个维度的信息,极大地满足我们进行生物组织荧光分析及诊断疾病的需要。LP_LCSMIS的工作原理可以简化为图2。如图2所示,每个线阵针孔阵列上的针孔都在傅里叶透镜的前焦面被Sagnac分束器横向剪切为两个虚像,s1和s2,可以在CCD探测器表面,即傅里叶透镜的后焦面获得两个虚像点源的干涉条纹。随着光程差的变化,光谱分布可以由对干涉图实施傅里叶变换得到。如图2所示,在探测器表面谱P点处,光程差为
式中d是横向剪切量;f′是傅里叶透镜的焦距;x是像点到轴的距离。随着装置与目标的相对运动,像点P的位置沿OP方向移动,光程差也随之变化。干涉图的强度分布为
式中v代表频率;v1和v2代表设计时的工作波段。由式(2)可以得到干涉图的强度分布。样品荧光的光谱分布可以由干涉图强度分布的傅里叶变换得到,如3式所示。
式中l代表最大光程差。由(3)式可以得到样品自体荧光的光谱分布。根据组织中存在的某些特征光谱成分信息,就可以判断样品中的化学组分,以至判断患者是否感染某种疾病。
LP_LCSMIS装置相对于以前研究的显微成像光谱仪有三个主要优点。首先,它具有较高的光谱分辨率。另一点,它采用了扫描共焦显微光学系统,有较高的空间分辨率和轴向深度解析力,能重构出组织内部的三维图像,实现立体成像。最后,它采用了空间调制成像光谱技术,能够提供更大的光通量,适合弱光探测,这在生物医学更为重要[9]。
2 线阵针孔阵列离焦对装置光谱和空间分辨率的影响
线阵针孔阵列是本装置的关键部件,在理想状况下,线阵检测针孔阵列恰好位于线阵光源针孔阵列的共焦位置,即傅里叶透镜的前焦面位置。但是,由于装配等种种原因,总会有一定的离焦量,这就对装置的空间和光谱分辨率与干涉图的调制深度都造成一定的影响[10]。
图3中δ代表离焦量。如图3所示,在理想情况下,针孔的两个虚像位于傅里叶透镜的前焦面上,通过傅里叶透镜以后,它们将成为两个互成一定角度相交的平面波,在CCD探测器表面发生干涉。当存在离焦时,针孔的两个虚像在透过傅里叶透镜以后将变成两个球面波,它们会以一个相同针孔的两个放大的虚像形式在探测器表面发生干涉。下面对存在离焦的情况进行分析。
如图3所示,根据牛顿定律,两个放大的虚像到探测器表面的像距为
如前所述,面阵CCD探测器表面收集到的干涉条纹是由虚像P1和P2干涉引起的。根据电磁波理论,两虚像点在点P(x,y,z)点处的电磁场强度分别是
式中E1,E2分别是电磁波的振幅。
总的电磁场强度为
比较式(2)和式(12),可以得出,离焦的存在会引起干涉图波数的漂移。当离焦量为正,即线阵检测针孔阵列向傅里叶透镜焦内离焦,实际测量光谱的波数值会小于理论值,当离焦量为负值时,结果相反。这种误差可以作为一种系统误差,通过定标予以消除。实际上,都是在保持前置系统和Sagnac分束器不动的情况下,前后微调傅里叶透镜,使得到的干涉图达到理想状态。
3 离焦对干涉图调制度的影响
干涉图的调制度为
式中IM是两束相干光在在探测器的同一点发生干涉以后的最大电磁波强度值;Im是最小强度值。为了达到最大的调制度,最大光程差必须满足下式
式中λ是电磁波的波长。根据式(6),(7),(8),可以知道,探测器表面的干涉图强度分布满足余弦分布[11]。于是,调制度可以表示如下式
根据式(15),只有在E1、E2相等并互相平行的条件下,调制度才能达到1。然而,如前所述,即使在理想状况下,E1和E2也是两个相交一定角度的平面波,所以装置中调制度永远小于1。
在离焦存在的的情况下,如前所述,E1和E2将成为两个相交于一定角度的球面波。如果离焦量为δ,设相交角度为α,令
式(18)显示,当离焦量增加的时候,调制度值将随之减小。为了获得大的调制度干涉图,必须在调整和装配阶段,尽可能的减少离焦量。另外,由于E1和E2的大小和方向差别对调制度的作用是互相独立的,只有适当调节两束光的光强比和振动方向之间的关系,才能获得调制度较大的干涉条纹。
4 结 论
在我们提出和正在研究的基于线阵针孔阵列的激光扫描共焦显微成像光谱仪结构装置中,线阵探测针孔阵列是其关键部件。线阵探测针孔阵列的离焦会极大地降低仪器的性能。离焦不但影响到装置的光谱分辨率和空间分辨率,而且会降低装置所获取的干涉图的调制度,最终影响到仪器获取光谱信息的准确性,这必将对装置获取到的生物组织的光谱信息和图像信息的正确性产生影响。我们分别导出了在离焦存在的情况,光谱分辨和调制度的公式,分析了离焦和光谱信息准确性的关系,这必将有益于设计性能良好的装置应用于生物检测领域。
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收稿日期:2005-09-23 E-mail:suxing-2000@sina.com
作者简介:苏星(1974_),男,陕西省人,西安光学精密机械研究所博士研究生,从事显微成像光谱技术,成像光谱技术微型化研究。
