摘 要 利用BACTEC-960全自动分枝杆菌培养鉴定药敏仪建立动物试验模型,以观察结核分枝杆菌(M.tuber-culosis. MT)MPT64质粒DNA疫苗预防结核病的效力。第一组小鼠接受H37RV攻击一个月后的肺、肝、脾培养结果:90%阳性标本培养时间为7~13天。肝脏仅75%出现阳性结果。第二组小鼠接受H37RV攻击两个月后,其肺、肝、脾培养结果:90%阳性标本培养时间为10~15天,肝脏仅60%出现阳性结果。第二组比第一组生长天数总体向后推迟生长时间明显集中,生长曲峰强度比第一组明显减弱,第二组在肝脏中的感染率比第一组有所下降。可能是因为小鼠经DNA疫苗刺激后,免疫力增强,使结核分枝杆菌生长缓慢之故。
当前,结核病在世界范围内疫情回升,迄今仍然是危害人类健康的主要传染病。据世界卫生组织统计,全球约1/3人口感染了结核分枝杆菌。近10年来有3000多万人死于结核病。结核病已成为传染病中的第一号杀手和最大的死亡病因之一。为探索结核病控制的新途径,利用BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养鉴定药敏仪建立动物实验模型,以观察结核分枝杆菌的MPT64质粒DNA疫苗预防结核病的效力研究。
1 材料与方法
1·1 材料
实验动物:BALB/C小鼠由北京药检所动物中心提供。
结核分枝杆菌强毒株(H37RV)由中国药品生物制品鉴定所提供。
MPT64质粒DNA疫苗由我院结核病研究室提供。
BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪及其相关试剂由美国BD公司提供。传统L-J培养基由本室自制。
1·2 方法
将BALB/C小鼠36只分为两组(第一组16,第二组20,每组又分对照组和DNA预防组),先用我院自行研制的DNA疫苗免疫两月后,用H37RV结核分枝杆菌强毒株(5×106CFU/ML)攻击小鼠。第一组被攻击一个月后,将小鼠杀死,用75%乙醇浸泡小鼠20分钟,开腹取出肺、肝、脾,用无菌生理盐水冲洗,然后放入组织研磨器内研磨,取研磨好的组织悬液0·1ml加入到0·9ml生理盐水中混匀,取0·1ml接种于L-J培养管中进行普通培养,40天时进行菌落记数。同时,取0·5ml接种于BACTEC MGIT 7H9培养管中,加入0·8ml添加剂,放入BACTEC MGIT960培养仪内进行培养。第二组被攻击两个月后,将小鼠杀死,重复上述操作步骤,用BACTEC MGIT960培养仪进行培养。需每日观察培养结果,若为阴性结果需培养42天。
2 结 果
用H37RV结核分枝杆菌强毒株攻击一个月(第一组)的小鼠肺、脾、肝培养结果,样本最快检出时间为6天,90%阳性样本检出时间为7~13天,最迟检出时间为40天,41~42天均无阳性样本检出。脾脏样本检出结核分枝杆菌为100%,肺脏次之,肝脏样本仅为75%(12/16)。小鼠肺、脾、肝用BACTEC-960培养的每天GI平均值分别为44·2;14·93;20·38,手工培养40天报告培养结果,其培养结果的总体趋势与960基本相同。
用H37RV结核分枝杆菌强毒株攻击两个月(第二组)的小鼠肺、脾、肝培养结果,样本最快检出时间为5天,90%阳性样本检出时间为10~15天,最迟检出时间为30天,31~42天均无阳性样本检出。脾脏样本检出结核分枝杆菌仍为100%,肝脏样本仅为60%(12/20)。小鼠肺、脾、肝用BACTEC-960培养的每天GI平均值分别为18·19;16·78;15·53。二组生长指数(GI)值的比较(见表1)中,肺和肝数值明显降
低,差异显箸(P<0·05 )。小鼠脾的数值无明显变化。手工培养结果与960结果相近。
3 分 析
BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪[1]通过MGIT培养管的底部包埋有荧光指示剂,荧光指示剂对溶解于培养内的氧气高度敏感。培养初期,大量的可溶性氧分子抑制荧光指示剂释放荧光,当分枝杆菌生长时呼吸消耗大量的氧气,这些荧光指示剂将释放荧光,BACTEC MGIT 960荧光强度记忆探测器将每隔60分钟连续测定培养管内的荧光强度,通过数据处理判断是否为阳性,以生长指数(GI)形式报告。BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养仪【1】
正是通过连续检测接种标本的培养管所显示的荧光强度的变化而判断是否有分枝杆菌生长的。
分枝杆菌的抗原既有共同抗原又有种的特异性抗原,其抗原总数多达100种以上。保护性抗原是种特异性抗原的决定簇,还是共同抗原的决定簇[3],或者二者兼备尚在研究中。在结核分枝杆菌的免疫应答中,哪一种抗原占主导地位、起主要作用就必须借助动物试验进行细致的研究。我院利用BACTEC960全自动分枝杆菌培养仪进行动物试验模型分析,研究资料显示我院研究室提供的DNA疫苗在小动物试验的预防过程中是有效力的, DNA组细菌计数下降率比载体对照组明显(见表2)。第二组比第一组培养时间明显向后推迟(第一组检出时间为7~13天)。同时,第二组的培养时间明显集中(10~15天),生长曲峰强度也比第一组明显减弱。以肝脏为例,第一组肝脏样本培养检出率为75%,第二组肝脏样本培养检出率仅为60%。可能说明小鼠免疫力增强,使结核分枝杆菌生长受抑制和生长速度减慢的原故。小鼠脾脏变化不明显,可能是因脾脏对该实验不敏感。据Kamath报道[2]用呼吸道气雾攻击小鼠4周时,MPT64DNA疫苗可使肺部结核分枝杆菌菌落数比载体对照减少0·3log10,与本试验同。但试验中也反应出小鼠个体生长指数差异明显。
岂今为止,未见有关BACTEC-960检测动物试验模型评价DNA疫苗的保护力的报道。通过试验摸索,将动物模型的组织液稀释10倍以上浓度为宜,以达到仪器培养计数的最佳效果。第一组阳性样本培养的时间最长为40天,第二组为30天,故用仪器进行分枝杆菌培养时间周期定为42天是合适的。BACTEC 960全自动分枝杆菌培养仪能计算出详细的生长数据(见表1),且两组最快生长时间5~6天,还能观察两组小鼠经DNA疫苗刺激后,生长密度和曲峰强度的不同,更祥尽了解结核杆菌生长的全过程,为实验工作提供快速、详细、精确的报告。
参考文献
[1] LeoNId B Heifets. Rapid Automated Methods (BACTEC system) inClinical Mycobacteriolgy, Semin Respir Infect. 1986(1):242
[2] Kamath AT, Feng CG, Macdonald M,et al. Differential Protec-tive Efficacy of DNA Vaccines Expressing Secreted Proteins of My-cobacterium Teberculosis. Infect Immun 1999,67:1702~1707
[3] Huygen K,et al. Immunogenicity and Protective Efficacy of a Tu-berculosis DNA Vaccine. Nar Med 1996,218:857~859
[4] 李洪敏,吴雪琼,王巍等.新型BACTEC-960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪及其应用.现代科学仪器,2000(2):61~62
本文作者：李洪敏 吴雪琼 金光莆 郑忠国* 阿布杜*
