摘 要: 为了在脑电信号波形的特定相位处施加电刺激，利用 NI 公司的通用数据采集卡和 LabVIEW 虚拟仪器环境，开发了一种闭环式电刺激系统。采集卡的 A/D 通道采样大鼠大脑海马区的场电位信号，LabVIEW 程序分析幅值和周期特性，预测即将到来的场电位 θ 节律的波峰或者波谷，并在指定相位处经由采集卡的数字口或者 D/A 通道输出所需的刺激信号，以实现闭环式刺激。实验结果表明，θ 节律波峰和波谷的预测正确率分别达到 92%和 86%。该电刺激系统的通用性和灵活性使其能够用于多种神经节律波相位以及其他信号特征的预测，为神经电生理研究和大脑疾病的电刺激治疗提供了一种新型闭环控制刺激方法。
1 引 言
在各种神经系统疾病的治疗中，大脑深部组织电刺激正在逐渐成为药物无法控制的许多疾病的首选治疗方案之一，其应用前景越来越广阔。例如: 临床上已经利用植入大脑的电极控制帕金森氏症引起的震颤等运动障碍[1]; 难治性癫痫病的电刺激治疗也正在开展临床试验[2-3]; 电刺激在治疗抑郁症、舞蹈病、老年痴呆症等大脑疾病的研究也进展迅速[4]。另外，脑组织电刺激也广泛用于神经通路、神经系统药理、突触可塑性和大脑学习记忆机制等方面的科学研究[5-7]。
闭环控制是这类电刺激应用的一个亟待发展的方向，它可以根据大脑的电活动状态，在特定时间施加电刺激。例如，在控制癫痫发作时，如果通过监测患者大脑的神经电信号变化来预测即将发作的癫痫，就能够提高电刺激的抑制效果[8]。实际上，脑组织神经细胞的电活动包含各种不同的脑电节律，形成场电位，幅值可达 mV 级水平[9]。场电位不仅可以用于预测癫痫发生的预兆; 而且，在场电位节律的不同相位上施加电刺激，会产生不同的效果。例如，在大脑海马组织常见的 θ 节律( 2 ～7 Hz)场电位下，当电刺激分别施加在波峰和波谷时可以诱发出 2 种截然不同的突触传导的改变，分别称为长时程增强和长时程抑制，从而产生兴奋和抑制 2 种不同的效果[5，10-11]。因此，闭环式电刺激技术对于深入研究神经 系统工作机制以及发展临床治疗新方法都具有重要意义[3]。
但是，目前各种电刺激器产品一般都无法根据脑电信号的变化状态来闭环式发生刺激信号。而且，脑电变化很快，不可能通过人工判断来实时地精确控制刺激信号的产生时间。例如，上述 θ 节律的波峰与波谷之间的间距小于 0.5 s。并且实际脑电记录的每个 θ 波的形状和周期都在不断变化，给特定相位的准确预测造成困难。本文利用美国国家仪器( National Instruments，NI) 公司的数据采集卡和 LabVIEW 开发环境，设计并实现了大鼠大脑海马区 θ 节律波峰和波谷的自动预测功能，可以根据用户的需求，在预期到来的波形相位上输出具备特定参数的刺激信号，提供了一种有效的闭环式电刺激方法。
2 方法设计
2. 1 刺激器系统的基本结构
如图 1 所示，整个刺激器系统的硬件组成包括: PC、NI 公司的 M 系列外置高性能 USB-6251 型数据采集卡、美国 A-M System 公司的 2100 型脉冲刺激器( 或者 2200型模拟刺激器、2300 型刺激隔离器) 和 1700 型四通道差分放大器( Everett，WA，USA) 。
系统在自行设计的 LabVIEW 程序控制下运行，如图中实线连接所示，记录电极检测的大鼠海马场电位信号经过放大器之后，经 USB-6251 型采集卡的 A/D 口采样，并经过实时分析，自动预测场电位节律的相位; 然后，根据用户的设置，在即将到来的特征时刻( 如波峰或波谷) ，经 USB-6251 的 I/O 口给出刺激脉冲触发信号，触发2100 刺激器产生恒压或恒流刺激脉冲; 该刺激信号经过刺激电极施加于神经组织的特定部位，如海马区的神经输入通路上，从而诱发神经元集群产生突触电位和动作电位。如果经 USB-6251 的 D/A 口输出模拟信号波形，并用于控制 2200 型模拟刺激器，则可以产生任意波形的刺激信号。
图 1 虚线连接所示是测试部分，利用 ADInstruments公司的 ML880 PowerLab 多通道记录系统同时采集脑组织场电位信号和刺激信号，用于分析系统预测 θ 节律的准确性。
系统使用的 USB-6251 采集卡具有 16 路 A/D 输入通道，分辨率为 l6 位，采样速率可高达1.25 MHz; 有2 路16 位 D / A 输出通道，分辨率为 l6 位; 还有 24 路数字 I / O口，2 个可编程 32 位定时器输入/输出通道等。本设计使用其中 1 路 A/D 转换采集脑电信号，1 路 D/A 转换输出模拟信号刺激波形，以及 1 位数字输出口产生刺激脉冲。利用 LabVIEW 提供的各种控件和模块来编程并控制 NI 采集卡[12-13]。
2. 2 系统软件设计
图 2 所示是刺激系统软件的总体框图，它包括数据采集与显示、信号节律分析、波峰波谷预测、刺激信号输出 4 个主要模块，下面分别介绍这些模块的实现方法。
2. 2. 1 数据采集与显示模块
程序利用 LabVIEW 的 DAQ Assistant 控件接收 USB-6251 采集卡高速 A / D 的输入信号，参数设置为单通道、模拟电压、连续读模式，采样频率设为20 kHz。程序启动时建立一个数组作为数据采样缓冲区，存放1 s 数据。数据更新采用队列模式，每次更新时删去缓冲区最前端的0. 1 s 数据，并在末尾补充最新采集的数据。缓存区中存放的数据既是虚拟面板上实时显示的内容，也是后台“信号节律分析”模块所分析的对象，这样保证了显示与分析内容的一致性。缓存区中既要有足够长的数据用于判断神经电信号是否 θ 波; 同时又要避免过大的缓存区会降低程序运行速度，影响实时性。
虚拟面板上设计的神经电信号显示采用实时显示控件 Wave Chart，刷新模式设置为带状图表，自右向左滚动显示。面板上还设计了调试模块，位于分页控件的第 2页，用于放置程序调试时使用的中间显示控件和中间参数等。调试面板与用户面板分离，分别为刺激器的使用和维护提供了方便。
2. 2. 2 信号节律分析模块
该模块分析当前数据缓冲区中存储的场电位信号是否具有 θ 波特性，如果是，就估计 θ 波周期，用于预测下一个即将到来的波峰和波谷; 如果不是，则将面板上的 θ波指示灯变为红色，提示用户注意当前脑电信号的状态。
海马组织自发场电位在实验记录过程中随时会发生变化，即使在脑电信号以 θ 节律为主的时期也会不时夹带短时程的非 θ 信号。为了正确预测即将到来的 θ 波峰和波谷，必须识别并跳过这些非 θ 波时段。
程序判断当前数据缓冲区中 1 s 信号是否是 θ 节律的依据有 2 条: 一是检查这段数据的幅值是否达到所设定的阈值范围; 二是计算这段信号节律的平均周期，并检查是否在 0.14 ～0.5 s 的 θ 波周期范围内( 即 2 ～7 Hz) 。
如果 2 条规则之一不满足，即认为当前信号是非 θ 波。如果此时用户按下了“运行”刺激按钮，并已设置参数，要求在 θ 波峰或者波谷发出刺激信号，那么，程序就弹出指示窗，等待采集信号中稳定的 θ 波到来之后，再根据预测发出刺激。
其中，θ 波幅值的阈值范围由用户根据前置放大器的输出来设定，平均周期值则是根据 1 s 带通滤波数据( 2 ～7 Hz) ，使用过零检测算法求得。该平均周期用于后续的波形相位预测算法。
2. 2. 3 波峰波谷预测模块
该预测模块采用双阈值法[5]，也就是先用设定的波峰波谷阈值确定 1 s 缓存区数据末端那个周期信号的波峰和波谷，再用已求得的平均周期进行延时，估计下一个波峰和波谷出现的时间。程序从缓存区数组的最后一个数据开始逐个向前推移，判断其值是否大于波峰阈值或小于波谷阈值，连续找到一个峰值和一个谷值后( 峰和谷的次序可不同) ，判断峰与谷之间的时间差是否在 θ 波周期范围之内。如果不是，则预测失败，将等待数据更新后再重新进行预测。如果符合条件，则根据已求得的平均周期和系统运行所需时间，从缓存区数据末端时刻开始插入延时，并在延时结束时输出刺激信号。
2. 2. 4 刺激信号的输出
刺激信号的输出有 2 种方式: 一是通过 USB-6251采集卡的数字 I/O 输出端口产生脉冲信号，作为通用刺激器( 如 A-M Systems 公司的 2100 型、2300 型刺激器) 的触发信号，然后由该刺激器产生所需频率、个数和幅值的刺激信号。二是由程序中设计的波形发生器，通过 USB-6251 采集卡的 D/A 转换口，产生方波、三角波、正弦波或双相脉冲波等任意模拟信号，信号的频率、幅值、持续时间以及脉宽等参数都可在虚拟面板上设置。再用它控制刺激隔离器( 如 A-M Systems 公司的2200 型刺激器) ，就可以产生各种幅值可变的恒压或者恒流刺激信号。
在 LabVIEW 程序中，以上 2 种输出方式都使用 I/O专用控件 DAQmx 组成的输入/输出任务环来实现。这样在程序的任何部位均可使用局部变量控件来调用该输出任务。本设计中数字脉冲信号输出通道选为 PO. 0，模拟波形信号输出通道选为 AO.1。
2. 3 动物实验
成年 SD 大鼠( 250 ～350 g，购自浙江省医学科学院实验动物中心) ，用乌拉坦( Urethane 1. 5g/ kg) 腹腔注射麻醉后，固定在大鼠脑立体定位仪上，切开头部皮肤，打开一侧大脑部分颅骨，经大脑皮层，将记录电极植入到海马 CA1 区，并将刺激电极植入到 CA1 区的神经输入通路Schaffer 侧支上。记录电极为线性排列的微电极阵列，分别在 CA1 区锥体神经元的胞体层和顶树突层记录场电位信号[14]。信号经过 1700 型四通道放大器放大，滤波频率范围设置为 0. 1 ～ 5 kHz。选择 θ 波比较明显的顶树突层的一路信号接入上述刺激系统 USB-6251 采集卡的 A/D 通道，用于实时 θ 波预测。采集卡输出的刺激信号则接至 2100 型刺激器的触发端，设置此刺激器产生脉宽为0.1 ms、强度为0.1 ～0.4 mA 的方波脉冲，输出到刺激电极( 见图 1) 。
2. 4 系统性能的测试和评价
利用 10 只大鼠的动物实验数据对系统预测 θ 波的准确性进行了测试和评价。如图 3 所示，将原始场电位信号和系统根据预测结果输出的脉冲刺激信号同时记录下来( 图 1) 。为了避免场电位信号受到刺激的影响，测试时并没有将电刺激实际施加到神经通路上，这样，在记录之后，可以离线计算预测算法的准确性。预测准确性用百分比误差 E 表示:
3 实验结果
图 4 所示是系统程序的虚拟面板，其中包括场电位采样信号、波峰波谷测试阈值的设定、平均周期的显示、θ节律指示、输出刺激信号的选择和参数设置、以及预测选择等。
表1 所示是 θ 波预测准确性的统计结果，系统在预测时有效地避开了非 θ 波时段( 见图 3) ，共预测波峰 544 次和波谷451 次，两者平均预测误差都小于 15%。图 5 用直方图分别显示了波峰和波谷预测误差的分布，横坐标为误差 E，纵坐标为 E 值落在相应区间的预测次数占总数的百分比率。如果把整个 θ 波近似看作波峰和波谷各占一半周期，并将预测误差小于 25% 的作为准确的预测，那么，波峰预测的准确率为 92%，比波谷的 86%要高。经分析发现，海马 CA1 区场电位 θ 波的波峰和波谷持续时间的分配并不均匀，多数波峰较窄而波谷较宽。
计算 10 组场电位数据 θ 波( 即 2 ～7 Hz 带通滤波信号)的峰峰幅值半高宽( 见图 3 所示) ，结果表明正峰半高宽仅占 θ 周期的44.2 ± 2.1%。较宽的波谷上叠加频率较高的信号之后，波谷的最低处位置变动较大，因此，增加了预测的难度。表 1 中依照波谷计算的 θ 波平均周期的标准差比依照波峰计算的要大，也说明了这一点，因此，波谷预测的准确率较低。
图 6 所示是将双脉冲刺激施加于 Schaffer 侧支时CA1 区 2 个层次上记录的信号，刺激强度为 0. 2 mA。图6a 的左侧显示了电极上 2 个记录位点和神经元的示意图，用于说明胞体层和树突层。根据刺激前树突层场电位中明显的 θ 节律可以判断，图 6( a) 和( b) 的刺激分别位于 θ 节律的波峰和波谷。诱发电位的放大波形显示了双刺激在胞体层产生的神经元集群动作电位( PS1 和PS2) ，以及在树突层产生的兴奋性突触电位( EPSP1 和EPSP2) 。可见 2 次刺激的 PS1 和 PS2 幅值存在明显区别，可用于深入研究电刺激作用的机制。
4 讨 论
本文利用通用 NI 采集卡、刺激隔离器和前置放大器开发了一种闭环式电刺激系统，用于实现大鼠大脑海马CA1 区场电位 θ 节律相位的自动预测并输出刺激信号，其特点分析如下:神经组织场电位的节律变化多端[15-16]，有 δ 波、θ波、α 波、β 波、γ 波和高频纹波等，频率范围在 0 ～300 Hz，这些波形随时可能出现和消失; 而且，即使在同一种节律下波形的各个周期也都含有随机变化的成分，致使波形相位的准确预测很困难。因此，本设计在预测中采用了两步法，一是以 1 s 长度为单位，判断当前场记录的电位信号是否属于 θ 节律状态，并在面板上给出提示，同时计算 θ 节律的平均周期; 这样，当出现刺激需求时，可以自动跳过非 θ 时期。二是在发出刺激信号之前，寻找波峰和波谷时再次确认最后采集的一个波形是否是θ 节律。而且，在估计即将到来的波峰或波谷时采用 1 s信号的平均周期，尽可能避免场电位突变以及依据单个θ 波周期可能引起的较大误差[5]，从而在场电位多变的情况下也能够获得高于 85%的预测准确率。
本系统具有较好的通用性和灵活性，只要配备 NI 采集卡，在广泛应用的 LabVIEW 环境下[17-18]，就能够方便地将电生理实验室常用的刺激器和放大器连接成闭环式刺激系统。除了预测 θ 节律的相位以外，只要适当调整LabVIEW 程序中相应的参数，就可以用于预测其他节律波形上的相位点，或者用简单的阈值法监测大幅值的痫样棘波等的出现时刻，以实现闭环控制的电刺激。而且，除了用于植入式电极的测量信号以外，也可用于头皮脑电图等非侵入式测量方法。
本设计采用 USB-6251 型高速采集卡，并且采样频率设为 20 kHz。如果仅仅用于分析较低频率的场电位，可以采用低速采样卡。本文使用较高的采样频率是为了考证 LabVIEW 程序的实时性，为今后拓展快速变化的峰电位等信号的监测打下基础。
另外，与脑电中癫痫征兆等信号特征的预测不同[2，8]，本文预测的是场电位波形的相位，因此，其时间精度要求更高。
5 结 论
本文利用 NI 公司的通用数据采集卡和 LabVIEW 虚拟仪器环境，开发了一种闭环式电刺激系统，可以预测大鼠海马等脑区的场电位信号中 θ 等节律波的特定相位，并给予刺激。这种闭环方式为研究大脑神经系统工作机制、揭示电刺激对于神经的作用机制以及开发治疗大脑疾病的方法提供了新型电刺激模式。
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作者简介
封洲燕，博士、教授，现任教于浙江大学生物医学工程及仪器科学学院，主要研究领域为生物医学信号处理、神经电生理、医学仪器等。E-mail: hnfzy@ yahoo. com. cn
陈丹，2009 年获学士学位，现为浙江大学硕士研究生，主要研究方向为生物医学信号处理。E-mail: wendy_specialmail@ 126. com
