1 引 言
随着光电技术、计算机信息技术和化学计量学方法的发展,现代近红外光谱(NIR)技术以其分析速度快、精度适中、成本低、非破坏性和易于实现无损、实时分析等优点在农业、食品、医药、烟草、石油化工等领域中得到广泛应用[1-6]。玉米的蛋白质含量是玉米品质的一个重要理化指标,采用传统的化学分析方法需要做复杂的预处理,且需要化学试剂进行化学反应,不利于环保,而且测样时间长,过程繁琐,对分析人员的技能要求很高,无法适合在农田实地进行快速简便的定量测试分析。近年来,国内外已在实验室开展了用近红外光谱技术分析玉米成分的工作[3,5,7-8],其中如何通过优化定标模型指导光电系统设计、研究小型专用光谱仪等具有重要意义。
本文采用近红外漫反射光谱技术,用傅里叶变换近红外光谱仪对177个玉米样品采集光谱。利用偏最小二乘法(Partial Least Square,PLS)建立玉米蛋白质含量的定标模型。首先采用多元散射校正方法对光谱进行预处理,再进行原谱、一阶导数谱和二阶导数谱的平滑化处理。选取波段:全谱、合频、一倍频、二倍频和蛋白质基团等5个波段,每个波段都分别采用原光谱、一阶导数谱、二阶导数谱,建立了15个定标模型。为了提高模型精度,本文通过同时调整平滑点数和因子数,对每个模型都分别做了多次PLS数值实验比较,得到每个模型的最优平滑点数、因子数和和预测均方根偏差(Root Mean Squar Error of Predica-tion,RMSEP),按照RMSEP值再从15个模型中选优,确定定标效果最好的波段,为设计小型便携式玉米蛋白质测定专用近红外光谱仪提供指导和依据。
2 实验部分
2.1 实验材料
成都某研究所提供了东北产玉米样品。经过外观观察,剔除颜色异常、质量异常的玉米,筛选得到177份样品。样品用带有1.0 mm孔径筛网的粉碎机磨碎。玉米样品蛋白质含量的参考化学值的测定采用凯氏定氮法(参见国标GB/T5511-85)获得。
选取其中139个为定标样品,其余38个为验证样品。表1给出玉米样品蛋白质含量化学值的数据统计。
2.2 仪器和测量方法
选用了Nicolet公司的870傅里叶变换近红外光谱仪和漫反射附件。设置分辨率为16 ,光谱波段为10 000~4 000 (1 000~2 500 nm)。
转动样品池可有效减小由于样品不均匀带来的误差,反复装样可有效减小装样环节引入的测定误差,多次扫描可有效减小背景噪声的影响。本实验将充分混合均匀的样品装入漫反射附件,在样品池转动的情况下扫描光谱,每个样品经过反复装样5次连续扫描,每次扫描32遍,然后计算平均吸收光谱,实验室温度(23±1)℃。
2.3 光谱数据处理
采用目前使用最广泛的PLS[1,4,5,9,10]建立了定标模型。模型评价指标包括定标相关系数(Rc)、预测相关系数(Rp)、定标均方根偏差(RootMean Square Error of Calibration,RMSEC)、预测均方根偏差(Root Mean Square Error of Pred-ication,RMSEP)、相对定标均方根偏差(RelativeRoot Mean Square Error of Calibration,RRM-SEC %)和相对预测均方根偏差(Relative RootMean Square Error of Predication, RRMSEP%):
式中:yi为第i样品的常规方法测定得到的参考化学值;yic为定标集中第i样品的预测值;yip为验证集中第i样品的预测值;ymc为定标集中样品化学值的平均值;ymp为验证集中样品化学值的平均值;n为定标集的样品数;m为验证集的样品数。
多元散射校正(Multiplieative Scatter Cor-rection,MSC)的作用是校正吸收基线并降低样品散射作用对光谱的影响,降低样品的不均匀性带来的光谱差异性[9-11]。因为本实验的样品为固体,并采用漫反射附件测定,颗粒度不是很均匀,因此,实验中的所有光谱都先用多元散射校正来做预处理。
合理的光谱平滑化和光谱求导(一阶、二阶导数光谱)处理可以消除基线漂移和平缓背景干扰形成的高频随机噪声的影响,从而提供比原光谱更高的分辨率和更清晰的光谱轮廓变化,提高光谱信噪比[12-16]。本文利用Savitzky-Golay平滑化方法[17]来计算原谱、一阶导数谱和二阶导数谱。它与移动平均平滑法的基本思想类似,是利用多项式来对移动窗口内的数据进行多项式最小二乘拟合。平滑点数是重要的参数指标,平滑点数过少容易产生新的计算误差(噪音)从而造成模型精度下降,平滑点数过多则会使得包含样品信息的光谱数据磨光丢失,同样也会造成模型精度下降。
因此,合理使用平滑点数非常重要,但必须通过多次数值实验的反复比较,才能选取确定最优平滑点数。下面以平滑点数15为例,给出对应的一阶、二阶导数光谱的计算公式:
其中,ν为波数分别为原光谱、一阶导数谱、二阶导数谱的吸光度值,Δν为光谱数据的波数间隔,在本实验中,分辨率16 对应Δν=7.713()。
另一方面,偏最小二乘法是融合主成分分析和多元线性回归的新型化学计量学方法,其本质是先消除光谱共线性再做回归,其中因子数是最重要的参数,它对应了代表样品信息的光谱数据的加权组合的组数。如果使用的因子数过少,就不能充分反映样品信息,模型预测精度会降低,称为不充分拟合。如果使用的因子数过多,就会引入一些代表噪声干扰的成分数据,模型的预测能力也会下降,称为过拟合。因此,合理确定偏最小二乘法的因子数,对于充分利用光谱信息和消除噪声非常重要,但必须通过多次数值实验的反复比较,才能选取确定。
3 结果与讨论
图1给出了177个玉米样品的在仪器测定范围(10 000~4 000 )内的吸收光谱。由图可见,光谱重叠严重,吸收较弱。其中5 500~4 000cm-1、7 000~5 500 、10 000~7 000 分别对应分子振动的合频、一倍频、二倍频(含高频)波段。
图2给出了玉米样品的吸光度与蛋白质含量化学值的相关系数谱。由图可见,在每一个波长点上,177个玉米样品的吸收度与蛋白质含量化学值的相关系数都很低(绝对值低于0.22)。因此,玉米样品的蛋白质含量与任何单独波长点的吸光度没有显著的相关性,直接从图谱中某一个波长点来确定其含量是不可行的。由于样品光谱有多个平缓的吸收峰,因此必须考虑用多个谱区内的光谱数据来建立定标模型。
根据蛋白质的标志基团N-H基团在近红外谱区的吸收波长分布,本文对应筛选了下列三个波段9 800~9 430 、7 000~6 370 、5 100~4 360 来组合(参见图1),简称为“基团”,因为这个波段组合对应了样品的分子结构特征,尝试采用它的吸光度来定标建模,也有可行性。
本文分别对5个波段进行建模并比较预测效果从中选优。参见图1,5个波段分别是:全谱(10 000 ~ 4 000 )、合频波段(5 500 ~4 000 )、一倍频波段(7 000~5 500 )、二倍频(含高频)波段(10 000~7 000 )和蛋白质基团波段(9 800~9 430 cm-1+7 000~6 370 +5 100~4 360 )。5个波段都分别采用原光谱、一阶导数谱、二阶导数谱,共建立15个定标模型来比较优选。
采用偏最小二乘法建立了定标模型,其中RMSEP是最实质性的描述模型精度的评价指标,本文将它作为建模的优化目标,光谱预处理的平滑点数和偏最小二乘法的因子数是建模的预设参数,因此,这是一个双参数的目标优化问题。每个定标模型都设定3、4、5、6、7共5个因子数,并设定15、17、19、21、23、25、27、29、31共9种平滑点数,从而有45个参数组合,对每一个模型,每一个参数组合都分别做一次PLS数值实验,共做了15×5×9=675次PLS数值实验来比较选优。
利用Nicolet公司提供的TQ Analyst定量软件完成每次PLS数值实验。记录每次数值实验的参数(平滑点数、因子数等)和结果(每个验证样品的蛋白质含量预测值、RMSEP等)进行比较。
以全谱段的一阶导数谱为例,表2给出了每一个的参数组合(平滑点数、因子数)对应的数值实验结果(RMSEP)。其中,方块内的每一个RMSEP值的所在行最左端的数和所在列最上端的数分别是所采用的平滑点数和因子数。表内小方框内的RMSEP值,表示它是同一列中的最小值,通过它标明了同一因子数对应的最优平滑点数;表内用黑体和有下横线的RMSEP值,表示它是同一行中的最小值,通过它标明了同一平滑点数对应的最优因子数。从表2可以看出,每个因子数固定后对应的最优平滑点数并不相同,而每个平滑点数固定后对应的最优因子数也不完全相同。最优参数组合的因子数和平滑点数分别为4和23,最优RMSEP值是0.392(%)。如果先随意固定了某个因子数或平滑点数,就不一定会得到这样的全局最优结果。
由于因子数和平滑点数同时变化寻求最优定标模型的运算量很大,以往的研究很少能够做到这一步,但这是改善提高近红外光谱分析预测能力的一个重要措施,应该给予很好的关注。
表3给出了通过全部的数值实验比较得到的15个模型对应的最优的平滑点数、因子数和RM-SEP值。可以看出,所有15个模型的最优参数组合(平滑点数,因子数)都不相同,5个波段的最好的模型是:全谱(10 000~4 000 )为采用二阶导数谱、最优因子数、平滑点数和RMSEP值为(3,23,0.370);合频波段(5 500~4 000 )采用一阶导数、最优因子数、平滑点数和RMSEP值为(7,25,0.564);一倍频波段(7 000~5 500 )采用一阶导数、最优因子数、平滑点数和RMSEP值为(5,19,0.357);二倍频(含高频)波段(10 000~7 000 )采用一阶导数、最优因子数、平滑点数和RMSEP值为(4,25,0.561);蛋白质基团波段(9 800~9 430 +7 000~6 370 +5 100~4 360 )采用原光谱、最优因子数、平滑点数和RMSEP值为(7,23,0.490)。
最好的定标模型是采用一阶导数预处理后的一倍频波段(7 000~5 500 ),与这个模型的预测效果非常接近的是采用二阶导数预处理后的全谱波段(10 000~4 000 )。这两个模型对应得到的玉米蛋白质含量的预测值和化学值的比较分别在图3、4中给出。由图可见,这两个模型的预测相关系数(Rp)、RMSEP、RRMSEP分别为0.945,0.357,3.340%和0.950,0.444,3.461%。
因此,模型的预测精度比较高,预测效果很好。特别是采用一倍频波段(7 000~5 500 )的定标效果完全可以代替全谱波段,这为设计小型便携式的玉米蛋白质测定专用的近红外光谱仪提供了依据。
同时还看到,在原谱平滑化、一阶导数谱和二阶导数谱的预处理方式中,哪一个定标效果好,不能一概而论,而采用多少平滑点数和因子数等,也都要经过多次的数值实验对比来确定。
4 结 论
采用近红外漫反射光谱技术,用傅里叶变换型近红外光谱仪对177个玉米样品采集光谱。利用PLS建立玉米蛋白质含量的定标模型。首先采用多元散射校正方法对光谱进行预处理,再利用Savitzky-Golay平滑化方法来进行原谱、一阶导数谱和二阶导数谱的平滑化处理。选取下列5个波段:全谱(10 000 cm~4 000 )、合频(5 500~4 000 )、一倍频(7 000 ~ 5 500 )、二倍频(含高频)(10 000~7 000 )和蛋白质基团(9 800~9 430 +7 000~6 370 + 5 100~4 360 ),每个波段都分别采用原光谱、一阶导数谱、二阶导数谱,共建立了15个定标模型。(1)通过同时调整Savitzky-Golay平滑点数和PLS因子数,对每个模型都分别做了45次PLS数值实验,从中比较选优,得到每个模型的最优平滑点数、因子数和RMSEP值,按照RMSEP值最小的原则,再从15个模型中选优,结果表明,采用一阶导数预处理后的一倍频波段(7 000~5 500 )的定标效果最好。(2)采用一阶导数预处理后的一倍频波段(7 000~5 500 )定标建模,相应的预测相关系数、预测均方根偏差、相对预测均方根偏差分别为0.945,0.357,3.340%,模型的预测效果很好。(3)一倍频波段(7 000~5 500 )完全可以代替全谱波段,并得到更好的定标效果,这为设计小型便携式的玉米蛋白质测定专用的近红外光谱仪提供了指导依据。(4)要获得高精度的定标模型必须考虑波段的不同选取、不同光谱预处理方式的选取、不同平滑点数和不同因子数的选取等多种条件和参数变化下来比较选优,虽然运算量很大,但这是改善提高近红外光谱分析预测能力的一个重要措施,应该给予很好的关注。
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作者简介:曹 璞(1982-),男,暨南大学理工学院光电工程系研究生,从事近红外光谱方面的研究。E-mail: cphnly@126.com
通讯作者:潘 涛(1964-),男,日本理学博士,暨南大学理工学院光电工程研究所教授(特聘)、博士生导师。从事应用光谱、生物信息、应用数学等方面的研究。E-mail: tpan@jnu.edu.cn
