1 引 言
利用光学技术[1-5]检测生物组织是否病变是当前的研究热点。该技术是根据生物组织在病变前后所体现出的光学特性的变化,通过检测来判断其发生何种病变、病变程度如何等。光学技术的优点是可以快速、无损、非接触地进行测量,能够为医生提供及时,甚至实时的组织病变信息,可以避免一般医学检测方法给患者带来的痛苦,并可有效降低医疗成本。
在这些光学检测技术中,光学成像技术尤其重要。因为通过组织的病变图像,医生可以直观地进行诊断。特别是对于早期癌症,由于它几乎没有任何症状,现在常规的医疗检测技术无法及时有效地发现病变。但是,组织早期癌变时,癌细胞的形态信息相对正常细胞有明显的差别,对组织细胞进行成像检测,可能有效地发现早期癌变。目前,国外很多研究机构利用共聚焦扫描成像技术,即根据组织细胞固有的折射率差别造成的光学对比度差异进行成像,通过光学层析技术获取组织不同深度的细胞形态信息,结合高性能的光电子设备对组织进行“光学活检”。另外,内窥镜作为目前常规的医疗检测设备,一直用于对人体内部器官的观测和治疗。因此,研制结合共聚焦扫描显微成像术的内窥镜很有意义,对胃、肠、食道和子宫等器官早期癌症的发现十分重要。本文利用共聚焦显微成像技术建立了一套共聚焦内窥镜的成像实验系统,通过对该系统轴向分辨能力和横向分辨能力的测试,说明系统的分辨能力可以满足部分组织细胞成像实验的要求;对猪皮肤组织的实验测试,证实该系统能够分辨猪皮肤不同层的部分细胞,有一定的层析能力。
2 共聚焦内窥镜的工作原理及构成
共聚焦内窥镜层析成像系统利用单模光纤导入外部照明光源,单模光纤出射光经物镜组会聚于被测样品,样品反射和后向散射的光学信息被单模光纤接收,经单模光纤和分束器进入光电探测器,光电探测器转换光信号并输入计算机处理显示,计算机发出控制信号给扫描器,通过扫描获取样品不同空间位置的图像信息。为了满足实验设计的要求,共聚焦内窥镜层析成像实验系统的基本结构采用图1所示的框架,主要包括以下几个组成部分:
(1)光路系统(如图2所示):它由光源、物镜、反射镜、单模光纤、针孔、光纤调整架和透镜支架等组成,可以获取样品被扫描区域的光学信息。它的基本工作流程是:光源发出的照明光通过准直以后,通过半反半透镜分束进入耦合物镜,由物镜耦合进单模光纤并传向光纤远端;光纤远端出射的照明光被准直物镜准直后进入会聚物镜,通过会聚物镜照明固定在扫描平台上的测试样品,在样品被照明区域反射或后向散射的信号光再通过会聚物镜和准直物镜后进入单模光纤;单模光纤近端输出信号光通过耦合透镜和半反半透镜转向探测物镜,经过针孔过滤后进入光电传感器。
(2)扫描系统:由扫描控制器和三维电控平移台组成,用来实现样品在空间的三维扫描。扫描控制器发出一系列脉冲电压信号给电控平移台上的步进电机;步进电机每接收一个运动脉冲电压信号就旋转一个角步距,而接收的方向脉冲信号控制着电机的旋转方向;精密机械杠杆和螺纹导轨将步进电机的转动变成平移台的直线移动;三维电控平移台的每一个平台移动方向对应三维空间的一个维度。
(3)信号采集系统:由光电传感器和数据采集卡组成。它接收来自样品的反射或后向散射信号光,并且将光信号转换成电信号,再由光电传感器的内置放大器放大输出到数据采集卡接线板的模拟输入端;模拟电压信号通过传输电缆被计算机PCI插槽上的数据采集卡采集并转化成数字信号,数字信号保存在计算机硬盘内,以便对样品被检测区域的图像信息进行处理和重构。
(4)显示和控制系统:它实际上就是一台通用的计算机,利用图像处理程序来处理和显示样品被检测区域的图像,并且通过与电控平移台控制器建立的通讯关系,向扫描控制系统发出运动指令,使样品按照系统控制程序设定路线移动,从而让系统最终获取样品上不同空间位置的信息。
3 共聚焦内窥镜成像系统的分辨能力
3.1 轴向分辨能力
在共聚焦内窥镜成像系统中,当单模光纤作为照明光和信号光的传输媒介时,系统的轴向光强分布[6]可以表示成:
式中:K表示归一化常数,它与入射光耦合进入光纤的效率和光纤传输的信号光被探测器接收的效率有关;轴向坐标变量,其中z是照明光点偏离理想会聚点的距离,a为探头物镜组的入瞳半径,d1是光纤端面与探头入瞳面之间距离,λ是照明光的工作波长;参数A=(2πs0a/d1λ)2,其中s0是单模光纤的模斑半径。
由于轴向光强分布I(u)的半高宽度反映共聚焦内窥镜成像系统的轴向分辨能力,从式(1)可知参数A决定系统的轴向分辨能力,即入射光波长,单模光纤的模斑半径,探头入瞳半径和光纤与探头入瞳间距决定共聚焦内窥镜的轴向分辨能力。当参数A较大时,共聚焦内窥镜的轴向分辨能力约等于2A。
3.2 横向分辨能力
对于共聚焦内窥镜的成像系统,由于单模光纤的介入使得探头部分的成像总是完全相干的,而相干成像中的边缘判据[7]在共聚焦内窥镜成像系统中也成立,即边缘处的像强度总是远离边缘像强度值的四分之一,而且不依赖于光学系统参数。因此,可以根据边缘成像来分析共聚焦内窥镜的横向分辨能力。
对于一条垂直x3轴,位于x3=0处的直边,它的物函数及其傅里叶变换可以分别表示成:
则探测器接收到的直边像的强度可以由下式表示
C2是由单模光纤和探头组成光路系统的三维光学传递函数在焦平面的投影,式中积分范围是两个相距为fx的单位圆的重叠部分;横向坐标变量vx=2πx3a′/λd2,其中x3是焦平面上照明光点偏离理想会聚点的距离,a′为探头物镜组的出瞳半径,d2是照明光的理想会聚点与探头出瞳面的间距。当参数A较大时,横向分辨能力约为。
4 测量实验和结果
在共聚焦内窥镜成像实验系统中,选择氦氖激光器(632.8 nm)作为光源,输出平行光束直径约为2 mm,20×物镜作为耦合物镜,10×和40×物镜组合成探头,单模光纤作为传输媒介,针孔孔径为10μm。实验用单模光纤的工作波长在600~770 nm,数值孔径为0.13,模场直径(630 nm)为4μm。由于该实验系统没有采用扩束装置,且各物镜的光阑直径不同,根据上节参数A的表达式,获得在以上实验条件下该系统的参数A约为4,即系统轴向和横向分辨能力的理论值分别是3.5μm和0.7μm。
4.1 轴向分辨能力的测量
利用平面反射镜作为测量系统轴向分辨能力的样品,调节好平面反射镜的位置,使其基本与探头光轴垂直,轴向扫描范围是400步,电控平移台的步距设定为0.625μm,测量的数据经归一化处理后如图3所示,横坐标是移动的步距数,纵坐标是归一化强度,获得归一化轴向光强分布的半高宽度约为10μm,即系统的轴向分辨能力约为10μm。
4.2 横向分辨能力的测量
为了测试系统的横向分辨能力,采用了WT1005-62型V号鉴别率板。根据照明光通过鉴别率板的衍射条纹,使扫描光点位于第25号单元(线条宽度以及线间距等于5μm);再调节鉴别率板的轴向位置,使反射的信号光为最强;设定横向扫描范围是25μm×25μm,获取样品扫描区的图像。测量结果如图4所示,分别给出被扫描区域的归一化强度分布,条纹灰度图和y=10步处横切面的二维反射强度分布。根据直边像边缘判据,从二维反射强度分布获得系统的横向分辨能力约为1.9μm。
上述系统轴向和横向分辨能力的测量值与理论计算值存在比较大的偏差。这主要包含以下两个方面的原因:(1)实验用物镜考虑了载波片厚度引入的像差,但是测试样品时,没有加载波片而引入像差;(2)由于物镜调整架的精度限制,组成探头的两个物镜的光轴不完全同轴引入了像差。由此可见,必须设法消除或减小这些像差[7]来提高系统的空间分辨能力。同时,根据组织细胞的大小[8],从系统具有的横向和轴向分辨能力可知,该系统完全可能对一些组织进行层析成像实验。
4.3 生物组织的层析成像实验
测试的生物组织样品是从市场购买的未经任何处理的新鲜猪皮。用切片刀截取一小块长方形的猪皮,然后固定在电控平移台的载物台上,并且让猪皮的外表皮靠近镜头;手动调节样品轴向距离直到发现强反射信号光为止;设定横向扫描范围是50μm×50μm和轴向扫描范围为218.75μm进行测量;原始测量数据保存在计算机硬盘,通过Matlab[9]进行后期滤波处理后重构出猪皮层析图像。
图5表示在不同深度的猪皮横截面图像。图中标注Z表示样品相对测量开始点的轴向位置,单位是步距数,电控平移台的步距是0.625μm。从图5中可以清晰地看出,在共聚焦内窥镜成像实验系统的有效成像范围内,来自猪皮不同深度位置的截面图有很明显的变化。这说明该实验系统对猪皮有一定的光层析能力。
对比Z=0、5和10处的图像可知,它们对应的是猪皮角质层的图像。由于会聚物镜和猪皮之间没有放置匹配液,在猪皮表层和空气交界处存在相对较强的后向散射光,靠近会聚物镜焦平面的角质层就会反射或散射强的信号光。由于猪皮表面的皱褶,远离会聚物镜焦平面的角质层的反射信号相对要弱很多,从而导致图像的对比度较高,靠近会聚物镜焦平面的角质层呈现白色,而远离会聚物镜焦平面的角质层呈现灰色。这些图中右下部的灰色区域对应的就是猪皮表面在固定时没有完全压平造成的表面弯曲。在Z=0和5处的图像显示角质层偏离会聚物镜焦平面,且处在远离物镜的位置。在Z=10处的图像显示部分表皮已处于会聚物镜焦平面,由于角质层的细胞没有细胞核,处于会聚物镜焦平面附近的角质层细胞呈现白色。从Z>10以后处的图像可知:照明光已经进入Z=10处图像所示的角质层以内,由于照明光在表皮的散射和吸收,系统的信噪比降低,图像的对比度普遍要比表面处图像的弱。图中白点对应反射强的区域,即细胞核。根据皮肤表皮的显微结构特征[10]与Z=10处图像所示的角质层对应的区域推测,它在Z=30处大概是表皮的颗粒细胞层,在Z=50~60处大概为表皮的棘细胞层。对比Z=30和Z=50处的图像可知:颗粒细胞层的细胞核(不规则形状的亮斑点)普遍比棘细胞层的要大,而且分布更加零乱。这说明进一步提高系统性能,即可以用于皮肤组织的层析成像分析和测试。
5 结 论
为了能够利用光学技术检测体内组织的早期病变,本文介绍了共聚焦内窥镜实验系统的工作原理和结构,给出系统空间分辨能力的理论估算方法,建立了共聚焦内窥镜的实验系统,说明了系统测量值与理论值存在偏差的主要原因。实验结果证明:系统的轴向和横向分辨率分别约为10μm和1.9μm,可以对猪皮肤组织进行层析成像。
参考文献:
[1] DABBA T, GLASS M. Fiber-optic confocal microscope: FOCON[J].Appl. Opt., 1992, 31(16):3030-3035.
[2] GMITRO A F, AZIZ D. Confocal microscopy through a fiber-optic imaging bundles[J].Opt.Lett.,1993, 18(8):565-567.
[3] JUSKAITIS R, WILASON T, WATSON T F. Real-time white light reflection confocal microscopy using a fiber-optic bundles[J].ScanNIng, 1997, 19(1):15-19.
[4] SABHARWAL Y S, ROUSE A R, DONALDSON L,et al.. Slit-scanning confocal microscope for high-resolutionin vivo imaging[J].Appl.Opt.,1999, 38(34):7133-7144.
[5] 马军山,侯琳琳,付东翔,等.双荧光标记生物芯片激光共聚焦检测系统[J].光学精密工程,2005,13(6):727-734.
WA J SH,HOU L L, FU D X,et al.. Two-laser scanning confocal system for microarray analysis [J].Opt. Preci-sion Eng.,2005,13(6):727-734.(in Chinese)
[6] LIU Y, CHEN J B, REN Q S,et al.. Axial intensity in a fiber-optic confocal microscope[J].Opt.PrecisionEng.,2005,13(5):608-612.
[7] M.顾.共焦显微术的三维成像原理[M].北京:新时代出版社.
GU M.Principles of Three-Dimensional Imaging in Confocal Microscopes[M].Beijing: New Times Press.(inChinese)
[8] PARAS N P.生物光子学导论[M].杭州:浙江大学出版社.
PARAS N P.Introduction to Biophotonics[M]. Hangzhou: Zhejiang University Press.(in Chinese)
[9] 张培强.MATLAB语言[M].北京:中国科学技术出版社.
ZHANG P Q.Language of MATLAB[M].Beijing:China Sciense and Technology Press.(in Chinese)
[10] RAJADHYAKSHA M, GONZALEZ S, ZAVISLAN J M,etal.. In vivo confocal laser microscopy of human skinII: Advances in instrumentation and comparison with histology[J].J.Invest.Dermatol.,1999,113(3):293-303.
作者简介:刘 勇(1976-),博士,讲师,主要从事医用光学检测仪器的理论分析和设计的研究。E-mail:liuyong7612@sina.com
陈家璧(1946-),教授,博士生导师,主要从事光电精密测量技术,光学信息处理,光学全息与散斑技术的研究。E-mail:jbchenk@online.sh.cn
