摘 要:介绍了一种基于反离子电渗方法的非侵入式血糖监测系统。该系统通过集成恒电流源和双恒电势仪电路,配合高灵敏度介体酶传感器,实现了反离子电渗抽取和抽取至体表葡萄糖的检测。并且通过良好的降噪和提升采样精度的设计,有效提高了测量的准确性。根据所检测的葡萄糖浓度与组织液葡萄糖浓度以及血糖浓度间相对稳定的对应关系,本系统可以自动计算出血糖浓度。经过动物实验验证:该无创血糖监测系统经过一次有创校准后能够实现血糖监测。对比常规的有创测量方法,在动物血糖自然变化状态下,该系统的监测结果能够很好地反映出血糖的平均浓度值;在人为干预动物血糖浓度的情况下,该系统的监测结果能够较好地反映出血糖的变化趋势。
1 引 言
糖尿病已成为严重危害人体健康的慢性非传染性疾病。糖尿病在中国的严峻形势更是发人深省。截止2003年,中国已经成为糖尿病第二大国,拥有2380万糖尿病患者,仅次于印度[1]。血糖监测是对前驱糖尿病患者和糖尿病患者诊断和治疗的重要依据,同时连续的血糖监测有助于改善自身膳食结构,预防糖尿病。无创检测技术应用于临床测量[2]成为了近年来研究 的重点,常见的无创测量方法有很多种,例如能量代谢守恒法[3]、光声光谱法[4]、近红外光谱法[5]、反离子电渗法[6-7]等。其中,反离子电渗法配合高灵敏度介体酶传感器[7],能够有效地排除其他生物物质的干扰,同时具有极高的检测灵敏度。
基于上述技术背景,本课题组前期研发了一款无创血糖仪[8],并进行了一系列模拟实验和动物实验。在之前的无创血糖仪及其实验数据的基础上,本文设计了一种新的的无创血糖监测系统,该系统采用一种新的血糖浓度计算方法,并对反离子电渗电路和检测电路进行了改进,以提高本系统的测量稳定性和可靠性。本文还设计了相关的动物实验,通过实验验证了本系统对于测量
2 检测原理
动物皮肤起着隔绝动物体内组织与外界环境的作用,目前已有多种方法能经过皮肤传输各种物质。基于反离子电渗抽取(以下简称为抽取)的经皮无创血糖检测就是其中的一种方法,其目的是为了突破皮肤的隔绝作用,建立皮下组织至体表传感器的葡萄糖传输通路。通过在体表施加一个电场,皮下组织中的带电离子在电场的作用下迁移至体表,其中正离子朝着阴极移动,负离子朝着阳极移动。Na+离子将作为中性分子迁移的载体[9]因此中性分子,如葡萄糖分子,将迁移至阴极。随着皮下组织中葡萄糖浓度的不同,迁移至体表的葡萄糖的量也不一样。最后根据抽取出的葡萄糖的量、皮下葡萄糖浓度和血糖浓度三者之间的相对固定的关系,计算出血糖浓度[10]。
动物皮肤能够存储葡萄糖等生物物质[11],这部分葡萄糖的量是未知的,因此为了使得测量结果稳定,在抽取前,需要先进行预抽取,将皮肤内原有的葡萄糖清理。预抽取之后,皮下组织至体表的葡萄糖传输通道已经建立,可以在同一部位进行连续抽取和测量。
本监测系统利用以锇离子聚合物为介体的高灵敏度葡萄糖酶传感器[12]作为检测传感器。该传感器具有高选择性、高灵敏度,可以有效地排除其他电渗至体表的物质的影响,能够测量出微量的葡萄糖(检出限为1μM), 同时在工作电极表面修饰了凝胶层,可以形成相对稳定的溶液环境,有助于葡萄糖的检测。为了配合反离子电渗抽取,在上述传感器的对电极上修饰Ag|AgCl浆,从而将对电极复用作反离子电渗的抽取电极,这样就形成了集反离子电渗和葡萄糖检测功能为一体的传感器与抽取电极复合体[13](以下简称复合体),如图1所示。
从图1可以看出,该复合体由2个完全一样的传感器以对称的形式构成,这2个传感器的抽取电极在抽取过程中分别作为施加电场的正负极,实施反离子电渗抽取。
3 系统设计
本监测系统包括多路切换开关、反离子电渗抽取电路、传感器后端电路、中央处理与控制模块、电源模块。系统框图如图2所示。
3.1 多路切换开关
本系统采用多路切换开关实现上述复合体的抽取和检测功能。当进行抽取时,将复合体连接至反离子电渗抽取电路;当进行检测时,将复合体连接至传感器后端电路。
3.2 反离子电渗抽取电路
鉴于本课题组的前一款仪表无法对抽取有效性进行判断[8],本文设计的仪表添加了反离子电渗抽取电路,如图3所示。图中I为恒流源,通过电流基准源芯片REF200实现,该恒流源输出100μA电流。R是一个小电阻,阻值为1Ω。恒流源输出的微电流通过抽取电极,流经皮肤,达到反离子电渗抽取的目的。
A为仪器仪表放大器,负责放大R上的电压降。当由于仪表佩戴不正确或实验动物运动造成抽取电极与皮肤未接触时,恒流源电路相当于断路,反离子电渗抽取没有进行,R上的压降为0 V,A的输出相应的也为0 V。反之,当反离子电渗抽取正常进行时,A的输出是一个与自身放大倍数对应的电压值。所以,A的输出可以作为抽取是否有效的判断依据。通过这种判断,能够自动去除一些抽取无效的数据点。
3.3 传感器后端电路
本系统中采用的传感器是一种电流型传感器,其工作电位为-0.1 V[12]。根据这一传感器特性设计的相应传感器后端电路如图4所示。这是一种经典的电化学传感器的后端电路[14]。图中的B1~B8为运算放大器,其中B1~B4构成图1中所示的传感器1的后端电路,B5~B8构成传感器2的后端电路。B1利用运放的输入端虚短特性,将电位e传至参比电极R1。同理W1受B3 的影响,电位为0,这样传感器1的工作电位VWR=-e。电路中使e =0.1 V,即得到了传感器所需的工作电位。B2为电压跟随器,其作用是为了减少R1和C1之间的电流,使得响应电流都流向工作电极W1,从而提高了传感器响应的线性度。B3将响应电流i1转换成电压,最后经过一级电压跟随器B4,输出电压Vout= -i1×R。从而获得了传感器1的响应电流。B5~B6的作用等同于B1~B4。在实现的过程中,利用2片集成了4路运放的OPA4336实现上述电路。利用低功耗高精度模拟数字转换器ADS1247将Vout转换成数字信号
本课题组的前一款仪表[8]对于无创检测时的背景电流无法有效的去除。针对这一问题,本文设计的仪表采用如下方案去除检测时的背景电流。这里假设传感器2在抽取过程中作为阴极。在抽取结束后,葡萄糖分子一般聚集在传感器2附近,在检测过程中i2将会包含葡萄糖分子的信号。本系统在检测过程中对传感器1和2的响应电流同时进行检测。由于传感器1附近没有葡萄糖分子,可以认为i1代表着检测系统的背景电流,这可能是由于皮肤电位引起的。i2则包含了背景电流和葡萄糖分子的响应电流。实际的葡萄糖分子的响应电流i可以表示为:
i = i2-i1 (1)
通过式(1)的运算,可以得到仅与葡萄糖分子相关的响应电流。同时,这种差分输出结构能有效地减小皮肤电位的影响和电路的噪声,对温度漂移也有一定的抑制作用。
3.4 中央处理与控制模块
本系统中通过以μC/OS-Ⅱ为内核的实时多任务软件设计,以MSP430F1611为中央微处理器,完成各项控制和信号处理功能。
3.5 电源模块
由于传感器的输出电流较小(nA级别),本系统通过2片独立的LP5951分别给数字系统和模拟系统供电,减小电路噪声对传感器输出信号的影响。系统的电能由一块内置的220 mA·h锂电池提供,通过良好的低功耗设计,系统的工作时间在10 h以上。
4 实验方法
4.1 仪器与试剂
实验中用到的标准葡萄糖溶液是用葡萄糖干粉(Sigma公司,美国)配置。磷酸盐缓冲液(phosphate buff-er solution, PBS)是用磷酸盐缓冲液片剂(Sigma公司,美国)加蒸馏水配置。实验中用于对比本系统测量结果的是GluCODr有创血糖仪(Allmedicus公司,韩国)。动物实验在中国中医科学院西苑医院动物实验中心完成。实验中用到的麻醉药是3%戊巴比妥钠,高糖溶液是50%葡萄糖注射液,这两种试剂由西苑医院动物实验中心提供。
4.2 实验动物
5月龄中国实验用小型猪Ⅲ系一头,实验过程中全程麻醉。实验过程维持约2 h。为了确保抽取的稳定,在室内进行实验,保持温度稳定、在进行实验的动物体表剃除毛发,并用PBS溶液浸润皮肤以保持恒定的pH环境[5],用医用胶布贴住复合体于猪的小腹右部,在固定的同时保持检测部位的通透性,如图5所示。
4.3 血糖浓度的计算方法
如前所述,抽取葡萄糖与血糖浓度之间存在相对固定的对应关系。尽管两者之间的对应关系较为复杂,在本系统中近似认为两者之间是比例关系。基于这种近似,可以用抽取至体表的葡萄糖表示血糖浓度。本课题组的前一款无创血糖检测系统采用的是计时电流法[8]进行血糖浓度的计算。在实际的实验中发现这种方法对环境的依赖性很强。针对这一问题,本文设计 的检测系统基于一种新的计算方式。
对于普通平面电极,在常规大体积溶液环境中的响应符合Contrell方程。
i(t) =KC0t-1/2 (2)
式中:K是常数,C0是样本的初始浓度。
抽取至体表的葡萄糖的量在pmol量级,在检测的过程中由于传感器上的葡萄糖氧化酶的不断消耗,使得传感器的i-t响应曲线并不满足式(2)所述的Contrell方程。经过前期大量的实验,发现对于微量葡萄糖检测时,传感器的i-t响应曲线可以近似的用以下方程代替
式中:K是常数,B是对传感器响应过程中双电层充电引入的常数,C0是样本的初始浓度,A(C0)是C0的函数。在动物实验的过程中,本系统记录整个检测过程传感器的输出,之后根据式(3)计算出C0作为抽取至体表的葡萄糖的量。
4.4 系统检测功能验证方法
当抽取时间设定为3 min,可获得的葡萄糖的量在50~500 pmol[9]。复合体中凝胶体积约为20μL。因此选取浓度为0~100μmol/L的20μL葡萄糖溶液,滴加在传感器表面,用本系统记录传感器的响应过程。通过最小二乘法拟合至式(3),计算出C0+B /K,并与被测溶液的浓度进行对比。
4.5 动物实验抽取有效性判断方法
如前所述,在抽取前要先进行预抽取。通过多次对比,将预抽取时间设置为30 min,预抽取的过程如图6所示。
预抽取结束后,将抽取时间分别设定为0 min、5 min、10 min、15 min,抽取完成之后直接检测得出传感器的响应曲线。由于抽取出来的葡萄糖的量非常少,传感器上的酶反应仍然满足一级动力学方程,即酶消耗葡萄糖的速率与葡萄糖的量成正比。对应的公式如下:
Y(t) =n×X(t) (4)
式中:n是比例系数,n≤1,X(t)是表示经过t时间的抽取获得的葡萄糖的总量,Y(t)表示在抽取时间t内传感器上的酶消耗的葡萄糖的总量。在抽取结束后剩余的葡萄糖的量N(t)结合式(4) 可以用式(5)表示:
N(t) =X(t) -Y(t) = (1-n)×X(t) (5)
由式(5)可知,抽取结束后剩余的葡萄糖的量与抽取获得的葡萄糖的总量成比例关系,所以可以在抽取结束后进行葡萄糖检测,并用检测结果表示抽取的总量。
4.6 正常血糖测量方法
动物正常喂饲,在喂饲6 h后用本系统进行血糖测量。期间使用上述有创血糖仪取猪耳静脉血进行有创血糖测量。以下有创血糖测量都是使用该方法进行测量。本系统在实验过程中获得10组数据用于后期数据处理;有创血糖测量5次,用于一次校准和对比。
4.7 人为干预血糖浓度测量方法
静脉推注50%葡萄糖注射液,注射量为55 mL[15], 5 min内注完,注糖后5 min、10 min、20 min、30 min、 50 min、65 min、85 min进行有创血糖测量。
5 实验结果与讨论
5.1 系统检测功能验证
对应不同浓度的葡萄糖溶液的系统响应如图7所示。从图中可以看出传感器响应曲线拟合至幂函数,其指数的倒数与被测的微量微浓度葡萄糖溶液浓度成线性关系,线性度较好
在实际的动物实验中,在未进行抽取时,进行一次检测,获得浓度为0的幂指数倒数;抽取进行后,获得某一浓度不为0的幂指数倒数,并辅以一次有创检测设备的校准。通过这两点即可建立幂指数倒数与被测葡萄糖浓度的对应关系,同时仅需要一次有创检测设备的校准。
5.2 动物实验抽取有效性判断
不同的抽取时间对应的传感器响应曲线如图8所示。
图中曲线用二次多项式进行拟合。以下曲线采用相同方法处理在抽取结束后,通过多路切换开关电路将复合体接入到传感器后端电路。由于这一过程会给传感器施加一个阶跃的工作电位-0.1 V,相应的传感器的输出也将经历动态和稳态2个状态。
抽取5 min时稳态电流近似于不抽取电流值,即5 min抽取量较少,经过100多秒的动态响应已经耗尽了所抽取的葡萄糖,使得传感器的响应回复到传感器的背景电流。而抽取10 min、15 min,获得的葡萄糖的量较多,在动态响应的过程中不能将获得的葡萄糖耗尽,使得传感器的稳态响应中包含了背景电流和葡萄糖分子的反应电流。抽取5 min、10 min、15 min的稳态响应电流依次增大,说明随着抽取时间的增加,抽取获得的葡萄糖的量依次增大,抽取是有效的。
本系统在后面的实验中设定抽取时间为5 min,检测时间为150 s,这样可以避免在连续测试中由于上次抽取量未耗尽对下次测量造成影响。同时抽取时间越短,检测频率越高,获得的血糖曲线越能够反映实际的血糖变化曲线。
5.3 正常血糖有创无创测量结果对比
在实验的2 h的过程中,猪的血糖值基本平稳。可以将测试结果对比如表1所示,其中所有数据以均数±标准差表示。
表1 正常血糖变化时系统监测结果与有创测量
方法对比
由表1可以看出利用无创方法测量获得的猪的血糖值与有创方法测得的猪的血糖值基本在一个范围内,二者的变化幅度相当。在猪的血糖值正常变化时,本系统能很好地监测猪的血糖。
5.4 人为干预血糖浓度有创无创测量方法对比
葡萄糖是动物机体的主要能量供应物质,正常情况下血糖浓度虽有波动,但是在神经-内分泌系统对血糖的调节作用下,血糖可以保持相对的稳定。图9为一次人为干预血糖浓度监测结果。从图9可以看出,拟合曲线中无创血糖测量的峰值较有创测量要延时13~16 min。原因可能是由于反离子电渗测量的是组织间液的浓度,而有创方法测量的是静脉血管中葡萄糖的浓度。实验中葡萄糖由静脉血管注入,扩散至组织间液有一定的延时。
从图中还可以看出,无创测量的峰值约为有创测量的50%。血液中葡萄糖浓度和体液中葡萄糖浓度是两个不同的参数,两者在正常状态下应该保持动态平衡。因此,可以用体液中葡萄糖浓度来反应血液中的葡萄糖浓度。在小范围的波动下,这个动态平衡还是可以维持的。在人为地注射了高浓度葡萄糖至血液中之后,血糖浓度迅速上升,如图9所示。这时,血糖和组织液葡萄糖的原有动态平衡被打破,平衡反应朝着组织液糖浓度升高、血糖浓度降低的方向进行,经过一定时间的交换过程,组织液葡萄糖浓度必然要大于原有动态平衡体系,但是由于所有的葡萄糖不可能全部交换至组织液,所以组织液葡萄糖浓度的增幅必然要小于血糖增幅。这个过程与可逆化学反应的过程类似。另一方面,由于动物体内分泌胰岛素促进葡萄糖的消耗,使得葡萄糖不断的在被消耗。这也是造成无创测量的峰值小于有创测量的原因。经过大约60 min,无创测量与有创测量重新表现出较好的跟随性。
从图9可以看出,本系统对于动物体的血糖变化趋势能较好的反映,对于连续监测动物的血糖变化有一定的参考价值。
6 结 论
本文介绍了一种基于反离子电渗方法的透皮无创血糖监测系统。在之前的模拟实验和初步动物实验基础上[8],设计了更适合于监测动物血糖变化的实验。首先通过实验确认检测和反离子电渗是有效的,之后针对中国实验用小型猪进行了一系列的实验。当小型猪血糖在正常范围内变化时,该系统的测量结果与有创测量方法接近;人为注射高浓度葡萄糖之后,该系统的测量结果对比有创测量值有较好的跟随性,峰值约为有创测量的50%,出现峰值的时间有一定的延时。这符合组织液葡萄糖与血糖间的对应关系。平均每8 min能够获得一组血糖数据,适用于动物血糖的连续监测研究。小型猪的糖代谢机制与人类相似[16],是研究人类糖代谢异常理想的模型动物。因此本研究中的结果对与研制针对人体的无创血糖连续监测系统有很好的参考价值。
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作者简介
肖宏辉,现为中国科学院电子学研究所硕士研究生,主要研究方向为生物医学检测系统研究。
蔡新霞(通讯作者),博士、博士生导师,现为中国科学院电子学研究所研究员,主要研究方向为生物传感器及微系统。E-mai:l xxca@i mai.l ie. ac. cn
