细胞的融合过程

　　⑻重复⑺一次。

　　⑼加1ml1640液，边加边摇动，持续0.5min。

　　⑽重复⑼一次。

　　⑾加1640液15ml。

　　⑿室温，400g离心1min，使细胞沉淀。

　　⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。

　　⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。

　　⒂轻摇后，放入5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。

　　⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。

　　⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。

　　⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。

　　（三）细胞融合的关键

　　1．技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。

　　２．融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。