一、目的和要求
1 学习和掌握用苯酚法及盐溶液法从动物组织提取核酸的原理及操作技术。
2 练习从动物组织提取RNA，并鉴定纯度。
二、实验原理
利用苯酚法可以直接从动物组织中提取RNA，组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水层中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后RNA即呈白色絮状沉淀析出。
三、操作步骤
1 称取3克肝组织，剪成小块，置于研钵中，加3-4滴90%的苯酚溶液后研磨，匀浆中加入15mL水，转移至三角烧瓶中，加10mL酚至三角烧瓶中。
2 室温下剧烈振荡45分钟，于3000rpm离心20分钟。
3 用吸管将上层液吸出，并加入1/2体积的氯仿-异戊醇，于低温下振荡20分钟，以除去提取液中的蛋白质，以2000rpm离心10分钟，吸出上层清液，向上清液中加入醋酸钾粉末，使最后浓度大约为2%，装入小烧杯后，一边搅拌，一边缓慢加入两倍于上清液体积的95%乙醇以沉淀RNA。
4 于冰浴中放置半小时后，以1000rpm离心5分钟，沉淀再用少量75%乙醇洗涤1-2次，收集沉淀，置于干燥器内干燥，称重。
5 测定A260/A280的值，应大于1.85，若小于1.85，则说明含杂蛋白和DNA高了。
四、试剂的配制
1. NaCl溶液（C.P.）（10%）
2. HCl溶液（6N）
取500mL浓盐酸，用水稀释至1000mL。
3. 乙醇（C.P.）（95%）
4. 苔黑酚试剂（又称地衣酚试剂）
将200mg苔黑酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mg FeCl3·6H2O。
（低温贮藏一周）
5. 二苯胺试剂
将1g二苯胺溶于98mL冰醋酸中，再加入2mL浓硫酸（比重1.84）。
（临用时配制，用前可加几滴乙醛。）
五、操作步骤
1. 取材
在天平上准确称取干酵母3.00g，转移至100mL锥形瓶中。
2. 浓盐浸提
取27mL 10%NaCl溶液，加入到含干酵母的锥形瓶中，搅拌均匀；置于90～100°C水浴中，浸提30～60分钟；冷却。
3. 离心
将锥形瓶中提取液和沉淀全部转移至100mL离心管中，取10mL H2O洗涤锥形瓶，并入离心管中；平衡后以4000转/分钟离心15分钟；将上清液（即RNA提取液）倾入50mL烧杯中，弃去沉淀（菌体残渣）。
4. 沉淀RNA
（1） 冷却：将50mL烧杯置于放有冰块的250mL烧杯中冷却；将温度计插入50mL烧杯中，待溶液冷至10°C以下时，取出温度计。
（2） 调pI：缓慢滴加6NHCl于50mL烧杯中，用玻棒一边轻轻搅拌溶液，一边测量pH值，调节溶液pH至2.0～2.5范围，溶液中白色沉淀逐渐增多，到等电点时沉淀量最多；继续在冰浴中静止15分钟，使沉淀充分。
（注意：①严格控制pH；②若搅拌过快核酸难以凝聚沉淀。）
5. 离心
将小烧杯中溶液和沉淀移至离心管中，再次平衡、离心（4000转/分钟，15分钟）；弃去上清液，保留RNA沉淀。
6. 洗涤与抽滤
（1） 洗涤：取10mL 95%乙醇加到含RNA沉淀的离心管中，悬浮沉淀，浸泡5分钟。
（2） 抽滤：取大小合适的滤纸，先在数字显示天平上称重；然后放入布氏漏斗中，用少量乙醇湿润滤纸，开启真空泵，使滤纸贴紧漏斗，将沉淀及溶液全部转移至布氏漏斗内；再用15mL 95%的乙醇洗涤离心管，淋洗滤渣。
7. 干燥
用小镊子取出布氏漏斗中的沉淀物和滤纸，转移至表面皿上，置于80°C烘箱内干燥。
8. 称重
取出样品，在室温下冷却数分钟后，将沉淀物及滤纸置于数字显示天平上称重。
9. 颜色反应
（1） 溶解：取50mL水溶解RNA沉淀，同时加2滴NaOH助溶。
颜色反应：取4支洁净、干燥的试管，按下表所示顺序操作
六、结果处理
1. 写出核酸产品的颜色和外形。
2. 计算RNA的粗产品的得率。
3. 由颜色反应的结果，说明产品中含有核酸的情况。
提示：本文动物组织核糖核酸的制备及测定属于动物实验文章，主要介绍核糖核酸、动物组织方面的知识，内容仅供学习交流与参考。
原文地址:/biotech/AnimalExp/2008/k8223947
