荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累检测PCR的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。其的报告基团分为3类：分别是嵌合染料SYBR Green、TaqMan探针和分子信标。在了解其操作方法前应该对扩增曲线、荧光阈值、ct值这3个重要概念作一些说明。
扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动录荧光强度的变化，其中横坐标反映荧光强度，纵坐标威循环数。
荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99。
Ct值：是指扩增到荧光阈值PCR所经过的循环数。通过此值可求样本中的模板数量。
试验中的操作技术：
样品的制备：提取到的DNA可放入TE缓冲溶液-20℃保存，如果提取RNA，应迅速反转录，得到的cDNA放于TE缓冲溶液-20℃保存，因为DNA和cDNA在缓冲液中会有部分降解，所以不适合长期保存，尽量使当天制备，当天使用。
PCR引物和探针的合成：定量PCR所扩增的片段长度一般都不超过300bp，这样才能确保结果更准确；染料法对引物的特异性要求较高，探针法对引物的特异性要求不高，探针法所扩增的片段长度更短，一般都在200bp以下。引物和探针都要进行Blast分析，以避免非特异性扩增，Taqman探针要求片段长度在50bp－150bp。
标准品的制备：
质粒或纯化后的PCR产物，这一步骤一般在预实验时完成，操作要求是将含有PCR产物的胶进行回收， 同时要将目的片段转化到大肠杆菌，用分光光度计测定含有PCR产物的质粒的OD值，借此来确定质粒的摩尔量，将已知摩尔量的质粒做5倍或10倍的连续梯度稀释，做成质粒标准品，这是准确测定样品中目的基因模板量的定量基础。现在也有的不做质粒，直接测定纯化后的PCR产物的摩尔量，然后梯度稀释PCR产物，以此来作为标准品。
（4）通道的选择及增益的选择：
对于任何一款荧光定量PCR仪来说，都有一组或几组激发光和滤光片以及相应的检测器和滤光片，这些就构成了定量PCR仪的通道。不同的发光基团都有相应的激发光和相应的检测器。定量PCR仪从最初的单通道发展到现在的多通道，常用的通道有FAM/HEX/JOE等。可根据自己所用的发光基团来选择相应的通道。增益（gain），是荧光信号的放大倍数，发光基团的荧光是很微弱的，必须经过适量的信号放大才能被检测，否则，整个扩增曲线的荧光强度非常小，以致无法准确检测。所以在实验前，要选择合适的增益倍数。
（5）标准曲线的制备：梯度稀释后，标准品的扩增曲线间距相等，标准曲线上的间距也相等，说明标准曲线建立的很成功，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因原始模板量的准确性。
（6）加样时的操作
所有的加样操作要围绕着尽量使反应体系均一化为目的，除了样品外，其他试剂都要进行预混，预混后分装到各个PCR管中，最后加样品，移液器要尽量准确，因为这一步的操作可以说是差之毫厘，谬以千里。
（7）扩增
所有操作完成后就是进行PCR扩增。
